[发明专利]一种HPV DNA基因分型的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种HPV DNA基因分型的方法及其试剂盒。

背景技术

宫颈癌已经成为世界范围内威胁女性健康的主要问题之一。据统计，每年大约有231,000的女性死于宫颈癌，其中，超过80%的新增病例发生在发展中国家。导致宫颈癌的主要病因是感染人乳头状瘤病毒(简称HPV)。有大约99.7%的宫颈癌病例都被检出携带HPV DNA，其中尤以16,18,31,45型最为常见。HPV从其致病程度上可分为四类，分别是高危型（16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,56,58和59型），可能高危型（26,53,66,68,73和82型），低危型（6,11,13,40,42,43,44,54,61,70,72,81和89型），以及未明确型（30,32,34,62,67,69,71,74,83,84,85,86,87,90,91型等）。其中，高危型因其易致宫颈癌发生而受到关注，而低危型尤其是6和11型易致尖锐湿疣等病变。HPV感染型存在多样性和地区差别。世界癌症组织的多中心研究提示，包含7种最常见型的疫苗可以保护世界上87%的患者。因此对HPV类型进行分型研究对于研究HPV相关疾病的发病机制，流行病学调查，判断宫颈癌病变风险，确定治疗方案，评价治疗效果和研究疫苗上都有重要价值。

目前，常用的HPV DNA检测的方法主要分为目标放大和信号放大。前者的最广泛的应用即是第二代杂交捕获法。后者则主要是基于PCR的方法，包括DNA直接测序法，DNA杂交法，PCR-RFLP法，反向线性杂交法等，这类方法灵敏度高，检测限可低至10到100个目标分子。酶联免疫和反向线性杂交等检测方法所需仪器和操作简单，但需要特异性的探针，成本相对昂贵，且有的不能检测出具体类型，或者只能检测出已知类型，不能达到良好的预测其致病程度的作用。相比之下，PCR-RFLP的方法具有可以检测出已知具体类型和未知类型的优势，有助于研究发病机制和流行病学的调查。

目前，对RFLP的检测方法多是基于不同长度FLP具有不同的大小，在筛分介质中具有不同的迁移时间而得以分离。最常用的筛分介质尤以琼脂糖或者聚丙烯酰胺为主。这种传统的凝胶电泳的方法操作繁琐，耗时，难以实现高通量和自动化。且对结果的分析，此种方法多用紫外检验荧光信号，灵敏度不高，再者因操作不当或条件控制不好致使条带的模糊或者弥散容易导致误差。

毛细管电泳法灵敏度高，可以实现对DNA的自动分离分析，并且自动收集检测峰信号，对核酸的分离分析十分适合。但传统的毛细管电泳仪器较大，且检测耗时较长，结果稳定性受环境影响也较大。近年来，核酸的芯片毛细管电泳以其微量快速自动化的特点成为核酸、蛋白质等生物分子毛细管电泳分析的发展趋势。芯片毛细管电泳又称毛细管芯片电泳或芯片电泳，该仪器以芯片为载体，毛细管为上样分离通道，使用聚合物溶液为无胶筛分介质对分析物质进行无胶筛分电泳，与常规的凝胶电泳不同在于，可对分析物质采用在线荧光标记激光诱导荧光检测，因芯片载体小，通道短，具有分析时间短，自动化程度高和分析通量大等优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种HPV DNA基因分型检测方法及其试剂盒。

所述方法为一种鉴定或辅助鉴定HPV DNA基因型的方法，包括如下步骤：

1）取待测DNA，用引物组X进行PCR扩增，若扩增产物中存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为含有HPV DNA的DNA；若扩增产物中不存在449bp-458bp的DNA片段，则将所述待测DNA候选为不含有HPV DNA的DNA；

所述引物组X由上游引物和下游引物组成；

所述上游引物由引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E中的五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种组成；

所述下游引物由引物PGMY09-F、PGMY09-G、PGMY09-H、PGMY09-I、PGMY09-J、PGMY09-K、PGMY09-L、PGMY09-M、PGMY09-N、PGMY09-P、PGMY09-Q、PGMY09-R和HMB01组成；

所述引物PGMY11-A、PGMY11-B、PGMY11-C、PGMY11-D和PGMY11-E分别为序列表序列1、2、3、4和5所示的单链DNA；