[发明专利]一种转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶，尤其涉及一种对酚类化合物转糖基效率高的β-半乳糖苷酶，属于酶蛋白工程技术领域。

技术背景

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)是一类重要的糖苷水解酶，催化β-半乳糖苷键发生水解。该类酶广泛存在于动物、植物和微生物中，能水解乳糖(Galβ1→4Glc)生成半乳糖和葡萄糖，在食品工业中有着广泛的应用，1998年被中国食品添加剂标准化委员会列为食品添加剂新品种，用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖，解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题等。某些种类的β-半乳糖苷酶在水解乳糖分子的同时，还具有转半乳糖基作用，即以乳糖或其水解产物为受体，转糖基合成功能性低聚半乳糖。

近年来伴随着糖基化工程的兴起，β-半乳糖苷酶的转糖基活性逐渐被延伸，被用于合成多种在食品业、工业、制药业等领域有着重要应用价值的半乳糖苷化合物，其中包括寡糖、烷基糖苷、芳香基糖苷及糖基缀合物等。目前报道的β-半乳糖苷酶在以单糖、寡糖、简单糖苷、醇类及其它复杂化合物为受体进行转糖基反应时，糖基化大都发生在受体分子糖环或烷基的羟基上，而芳香环羟基的半乳糖基化仅有一例报道，即采用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来源的β-半乳糖苷酶对对苯二酚进行糖基化修饰，生成的对苯二酚半乳糖苷比对苯二酚葡萄苷(熊果苷)的抗氧化活性提高了1.19倍。

酚类化合物为典型的带有芳香环羟基的化合物，具有非常重要的药理学活性，其糖基化修饰意义重大，但由于酚类化合物苯环羟基亲核性较低，天然糖苷酶以该类化合物为受体进行糖基化修饰难度较大。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶。

一种转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶来源于GenBank登录号为ACE06986.1的β-半乳糖苷酶，通过分子生物学操作将其第980位色氨酸用苯丙氨酸取代。

一种编码上述转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种插入了编码上述转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶的基因的表达载体。

一种重组细胞，含有上述表达载体。

优选的，所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后获得。

上述转苷底物特异性拓宽的β-半乳糖苷酶的制备方法：

人工合成GenBank登录号为EU734748.1的β-半乳糖苷酶基因序列(编码蛋白GenBank登录号为ACE06986.1)，将其连接到pET-21b(+)质粒上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后提取重组质粒，以质粒为模板，添加突变引物，采用突变试剂盒（全式金Easy Mutagenesis System,北京），通过PCR扩增反应在该酶基因序列中引入突变，PCR产物经Dpn I酶(TaKaRa)处理后，转化大肠杆菌BL21(DE3)。然后按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose by β-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275.]所述方法制备β-半乳糖苷酶突变酶。

上述β-半乳糖苷酶在糖基化修饰酚类化合物中的应用，步骤如下：

（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，酚类受体浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；

（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；

（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得酚类糖苷化合物。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的酚类受体选自咖啡酸、间苯三酚或白藜芦醇。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。