[发明专利]一种人工设计的青霉素G酰化酶原及编码序列和发酵方法

权利要求书

1.一种人工设计的青霉素G酰化酶原，其特征在于：包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α亚基和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β亚基。

2.根据权利要求1所述的人工设计的青霉素G酰化酶原，其特征在于：由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α亚基和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β亚基依次连接得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求2所述的人工设计的青霉素G酰化酶原的核苷酸序列，其特征在于：如SEQ ID NO.4所示。

4.一种表达人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体，其特征在于：将权利要求3所述的核苷酸序列重组于表达载体上得到。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为pET9a、pET28a、pET28a-c(+)、pET30a-c(+)或pET33b(+)。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：通过以下步骤得到：

（1）在权利要求3所述的核苷酸序列的5'端加上NdeI酶切位点，在3'端加上BamHI酶切位点，得到含有NdeI和BamHI双酶切位点的序列；

（2）通过NdeI和BamHI分别双酶切步骤（1）最终得到的序列以及表达载体；双酶切后的序列与双酶切后的表达载体连接，得到表达人工设计的青霉素G酰化酶原的重组载体。

7.一种表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株，其特征在于：将权利要求4所述的的重组载体转化到宿主菌株得到。

8.根据权利要求7所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株，其特征在于：所述的宿主菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21或大肠杆菌BL21(DE3)。

9.权利要求8所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：将表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株接种到发酵培养基中，进行发酵，具体如下：

①当表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株中的重组载体为诱导型表达质粒时，发酵条件如下：温度控制在28℃～32℃之间，pH值控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧控制在氧饱和度为5～50%，诱导剂IPTG的添加量在0.3mM～0.6mM；当碳源耗尽时开始补料，采用匀速补料，补料速率控制在0.5mL·min^-1·L^-1～1mL·min^-1·L^-1之间；

②当表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株中的重组载体为组成型表达质粒时，发酵条件如下：温度控制在28℃～32℃之间，pH控制在6.5～7.0之间，搅拌转速控制在150rpm～700rpm之间，空气流速控制在200L/h～1600L/h之间，溶解氧控制在氧饱和度为20～50%；当碳源耗尽时开始补料，初始补料速率0.2mL·min^-1·L^-1，逐步增大，氧饱和度不能低于为20%；

所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母粉2～5g、蛋白胨3～8g、氯化钠1～2g、磷酸二氢钾2～5g、磷酸氢二钠2～5g、二水合氯化钙0.01～0.02g、硫酸镁1～2g、甘油4～7g、硫酸铵5～7g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；

所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁20～30g、氯化锌1～3g、六水合氯化钴2～4g、二水合钼酸钠2～4g、二水合氯化钙1～2g、二水合氯化铜1～2g、硼酸0.4～0.6g、一水合硫酸锰2～3g、浓度为质量百分比37%的浓盐酸10mL，用水定容至1L；

所述的补料的组成如下：每升含有250～500g甘油，25～50g酵母粉，40～60g蛋白胨，余量为水。

10.根据权利要求9所述的表达人工设计的青霉素G酰化酶原的菌株的发酵方法，其特征在于：

所述的发酵培养基的组成如下：每升含有酵母粉3g、蛋白胨5g、氯化钠1g、磷酸二氢钾3g、磷酸氢二钠3.25g、二水合氯化钙0.014g、硫酸镁1g、甘油4.125g、硫酸铵6g、微量元素0.875mL；用水定容至1L，pH6.5～7.0；

所述的微量元素的组成如下：每升含有四水合氯化亚铁22.87g、氯化锌1.31g、六水合氯化钴2g、二水合钼酸钠2g、二水合氯化钙1g、二水合氯化铜1.25g、硼酸0.5g、一水合硫酸锰2.17g、浓度为质量百分比37%的浓盐酸100mL，用水定容至1L；

所述的补料的组成如下：每升含有500g甘油，25g酵母粉，40g蛋白胨，余量为水。