[发明专利]间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶突变酶合成间苯三酚半乳糖苷的方法，属于糖工程技术领域。

技术背景

间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)是一种优良的医药产品，早己被广泛应用于抗菌、抑制脾脏酪氨酸致活酶、苹果防腐等方面。近年来该化合物还成为临床新型亲肌性非阿托品非罂粟碱类纯平滑肌解痉药，其注射液在法国及其他欧洲国家得到了广泛的临床应用，已成为治疗痉挛性疼痛的首选药物。此外，间苯三酚还是重要的精细化工产品，可作为药物合成的中间体用于制备黄酮、异黄酮等抗癌、抗心血管疾病类药物及抗免疫缺损病毒(HIV)新药等。然而，间苯三酚也存在酚类化合物的缺点，如水溶性差、不稳定及光解等性质。

据文献报道，酚类化合物的糖基化修饰能增加水溶性和稳定性，改进药理学性质和疗效。目前尚无酶法糖基化修饰间苯三酚的文献报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供间苯三酚糖苷衍生物及其制备方法。

间苯三酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：

（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，间苯三酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；

（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；

（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得间苯三酚半乳糖苷。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶选用GenBank登录号为ACE06986.1，将第980位色氨酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备酶蛋白，上述β-半乳糖苷酶对间苯三酚具有显著转糖基活性。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离，型号Silica gel60F254(Merck,Germany).

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。

上述薄层层析检测的步骤如下：

薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。

上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。

有益效果

本发明以间苯三酚为原料，以廉价乳糖底物为半乳糖基供体，采用经过突变的β-半乳糖苷酶合成间苯三酚半乳糖苷，产物与其原料间苯三酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性，扩大了应用范围，该类化合物自身可作为新的化学合成中间体用以衍生合成新的高附加值化合物，在化工及制药业具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为间苯三酚糖苷衍生物1的质谱图；

图2为间苯三酚糖苷衍生物2的质谱图；

图3为间苯三酚糖苷衍生物3的质谱图；

图4为间苯三酚糖苷衍生物2的氢谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

间苯三酚糖苷衍生物，制备步骤如下：

1.β-半乳糖苷酶的制备