[发明专利]一种胆固醇氧化酶产生菌的筛选方法

权利要求书

1.一种胆固醇氧化酶产生菌的筛选方法，步骤如下：

1)初筛：将样品用无菌生理盐水稀释后，经过三到四次富集，再涂布于以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上，挑选能够产生棕红色的菌株；

2)复筛：将上述初筛菌株经活化后接种到发酵培养基中，30℃培养48h后测定胞外胆固醇氧化酶活性。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)中所述初筛过程的筛选固体培养基成分如下：磷酸氢二钾2.8528g L^-1，硫酸铵1.000g L^-1，磷酸氢二钠6.1242g L^-1，硫酸镁0.2500g L^-1，氯化钙0.0500g L^-1，胆固醇1.5466g L^-1，Tween-800.773mL L^-1，琼脂25g L^-1，邻联茴香胺(简称DA)0.1000g L^-1，辣根过氧化物酶(简称HRP)1000U，pH6.5。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述复筛过程的发酵培养基成分如下：葡萄糖10gL^-1，胰蛋白胨10gL^-1，酵母膏5g L^-1，胆固醇2gL^-1，Tween-801mLL^-1，pH6.5。

4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，所述酶活测定过程的测定体系成分如下：2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称ABTS)与HRP混合液3mL，胆固醇工作液200μL，粗酶液50μL。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述ABTS-HRP混合液配制如下：称取0.0183g ABTS和0.0021g HRP(250U/mg)，用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.2)溶解，定容至100mL。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述胆固醇工作液配制如下：称取0.0190胆固醇粉末溶解于脱氧胆酸钠溶液中(5％w/v)，定容至10mL。