[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I1C的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法。

背景技术

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈,全身感染死亡率高达20％，已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。新近研究证明，在MRSA所有致病作用因子中，金黄色葡萄球菌铁元素决定因子B蛋白（Factor B of surface Iron from Staphylococcus aureus,IsdB）不仅是MRSA一个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中起重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具，以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行Ⅱ期临床试验。金黄色葡萄球菌表面凝聚因子蛋白（Clumping factor A,ClfA）ClfA是MRSA非常重要的外膜蛋白，在MRSA感染的第一步粘附定植中起重要作用，针对ClfA单克隆抗体用于被动免疫接种的疫苗已完成Ⅱ期临床试验。

IsdB和ClfA都是MRSA的固有蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。我们已经构建了既能很好去除MRSA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程蛋白I₁C。目前尚未见针对（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白I₁C疫苗纯化方法的报道。

发明内容

本发明的目的：是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

本发明的技术方案是：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组蛋白疫苗I₁C的纯化方法，包括以下步骤：

（1）收集制备的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁C（参见201310021212.3的发明专利申请）；

（2）高压破菌：将收集的可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁C的大肠杆菌菌体以PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

（3）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集沉淀；

（4）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入10-20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、0.5M NaCl、2mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲液缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟以上，收集上清；

（5）GST亲和纯化：GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A(10-20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、10%甘油、5mM EDTA、0.5%Poloxamer188，pH7.0-7.5)缓冲液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱；

（6）Adhere层析纯化：步骤（5）收集的样品，使用A缓冲液平衡层析系统及Adhere层析柱，A缓冲液加1M NaCl，pH7.0-7.5的缓冲液线性梯度洗脱；

（7）凝胶过滤层析纯化：将步骤（6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤层析柱纯化，采用A缓冲液平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

步骤2）所述的高压匀浆破菌采用生产或中试纯化的60-80MPa，高速离心获取破菌上清。

步骤3）中加入硫酸铵分步沉淀再复溶。

步骤5）所述的GST亲和层析使用的填料为GST-Sepharose4B或GST-Sepharose6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose。