[发明专利]温敏微载体及其制备工艺和使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及细胞培养，特别涉及一种用于扩增培养和收获临床治疗用高质量高活性细胞的温敏微载体及其制备方法和使用方法。

背景技术

细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特征和功能的技术。来自于动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的，必须贴附在合适的固体介质上并铺展，才能开始生长。

传统的细胞培养是使用细胞平皿进行培养，平皿经过处理适于细胞贴附和生长，一个传统的平皿提供了78.52cm²并可以可支持10⁶-10⁷个细胞贴附生长。随后，人们开始使用细胞转瓶，滚瓶、以及中空纤维等装置进行细胞培养。

微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可使该离子交换凝胶成为微小的颗粒悬浮在培养基中，由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖，而且载体处于悬浮状态不仅可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。

良好的细胞培养微载体具有以下特点：表面积/体积（S/V）大，单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；容易进行放大培养；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，由于其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且放大容易，已广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞等。

但是，在把微载体培养由实验室规模放大到中试甚至工业生产规模时，传代被认为是限制性的一步。目前常用的传代方法有两种 ①不依赖于蛋白水解酶的微载体细胞传代，即基于某些培养细胞能在微载体间自动解离和转移的现象，加人新鲜培基和微载体进行扩大培养，但这种方法仅限于少数细胞系，如CHO细胞、CHO工程细胞、鼠成纤维细胞、内皮细胞等，而不适用于所有细胞； ②依赖于蛋白水解酶的微载体细胞传代，即先用蛋白水解酶将细胞从微载体上消化下来作为下一级的种子细胞，再加入新鲜培基和微载体以增殖细胞，用于这一用途的酶有胰酶、葡聚糖酶、胶原酶等，它们可单独使用或混合使用，该方法在理论上可行，实际生产中也比较常用，但经过胰酶消化不但会使细胞受到一定伤害，还可能会破坏微载体的部分结构，造成细胞贴壁率降低，微载体利用率下降，影响细胞的扩大培养，特别是当大规模培养时，还存在着劳动强度高，污染几率大的弊端。

细胞治疗是利用患者自体(或异体)的成体细胞(或干细胞)对组织、器官进行修复的治疗方法，广泛用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨头坏死、恶性肿瘤、心肌梗死等疾病。治疗用细胞要求高质量，高活性，细胞外基质和表面蛋白保存完整。而上述的细胞培养方法较难达到该要求。

虽然近年有文献报道（N.E.Timmins,M.Kiel,M.Gunther,etc. Closed System Isolation and Scalable Expansion of Human Placental Mesenchymal Stem Cells.2012），研究者利用微载体大规模培养来源于人胚胎的间充质干细胞用于临床治疗目的。但是不管是用微载体还是用之前组织培养聚苯乙烯（TCPS）构成的传统培养皿进行细胞培养，都需利用胰蛋白酶的蛋白水解作用使细胞外基质（ECM）分解和用乙二胺四乙酸（EDTA）络合Ca²⁺ 与 Mg²⁺的方法回收细胞，然而，非特异性的蛋白酶会破坏重要的细胞表面蛋白质，这就是这类细胞回收方法的主要缺陷，该方法费时，费力，细胞收获效率较低。此外，从细胞组织工程的角度来说，对新形成的组织结构的破坏，可以说是一种退步。

现有的细胞培养微载体有Cytodex1和Cytodex3等商业化产品，但是使用这些传统微载体具有费用昂贵，细胞消化时会对细胞表面蛋白造成损伤等缺点，大大限制了其在细胞治疗领域的应用。

发明内容

为了克服上述传统细胞回收的风险和问题，本发明提供了一种温敏微载体及其制备方法，以及将其用于细胞培养的方法。