[发明专利]基于颜色的逆转录等温扩增技术检测肠道病毒基因组5’-UTR

说明书

发明领域

本发明是用基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术(Reverse transcription isothermal genome exponential amplification reaction，RT-GEAR)检测人感染肠道病毒基因组5’端非翻译区(5’-Untranslated region，5’-UTR)。用于各级疾病预防控制机构，手足口病检测网络实验室，哨点医院对人感染肠道病毒的检测和监测。

发明背景

肠道病毒感染广泛分布于全球各地，人的一生中往往会经历多次感染。肠道病毒可直接引多种疾病，如手足口病、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、疱疹性咽峡炎、结膜炎、流行性肌痛、甲型肺炎等。2008年以来，由肠道病毒引起的手足口病出现大规模流行，发病人数呈快速上升趋势，范围遍及全国，引起国家和社会的广泛关注。

手足口病(Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、埃可病毒等18种肠道病毒血清型。

为有效阻止疫情的爆发和发生疫情后的应急处置，根据卫生部应对手足口疫情防控要求，我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行病毒检测的能力，及早发现可能出现人传人病例，切实做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术检测人感染肠道病毒基因组5’-UTR方法，将为提高我国疾病监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对手足口病人的快速筛查提供了有力的技术保障。

基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术(RT-GEAR)在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到1小时以内，灵敏度可达到检测1000个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在63℃等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中五个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-GEAR的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测结果。

发明内容：

1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，检测时间短灵敏度高。整个检测时间可缩短至1小时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。其次，特异性高。所设计的四条特异性引物，只在其与识别靶序列中五个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行。然后，所有的扩增过程都可在63℃等温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。最后，污染机会低和结果可视化。。

2.选择肠道病毒基因组5’-UTR(Untranslated region，非翻译区)的相对保守区设计相应的RT-GEAR引物，针对每个基因分别包括两条嵌合引物(FT、BT)和两条加速引物(IF、IR)。所有引物的具体序列见表1。

表1：逆转录等温扩增技术检测肠道病毒基因组5’-UTR的引物序列