[发明专利]一种检测血小板衍生因子的化学发光成像核酸适体传感器

说明书

技术领域    

本发明涉及生物技术领域，利用核酸适体与血小板衍生因子（PDGF-BB）的特异性识别作用，采用化学发光成像技术建立生物传感器，实现对PDGF-BB的高灵敏、高选择性检测。

背景技术

化学发光法与成像技术相结合，开创了发光分析的新领域。化学发光成像分析（chemiluminescence imaging，CLI）因其高分辨率、高通量、电感耦合装置（charge-coupled device，CCD）的光谱响应范围宽、高灵敏度等特点而广泛应用于生物医学研究、疾病诊断及药物开发等领域已引起人们的广泛兴趣，为活细胞中酶定量、代谢、抗原与核酸等方面的研究提供了有效手段。化学发光成像多采用化学发光标记物，其检测能力较光度计荧光检测方法均得到改善，较常用的放射性同位素标记法也更为有效，可满足单细胞或部分组织成像要求高检测能力及空间分辨率等的要求。Luo等利用增强化学发光成像技术，实现了重组肿瘤坏死因子（TNF-α）的检测，其检测的线性范围达9.0 ~ 312.0 pg/mL，检测限可达1 pg/mL（Anal. Chim. Acta, 2005, 539, 277-282）。Wang等利用FCLA与活性氧自由基反应产生光信号，采用成像技术成功地对小鼠体内的肿瘤进行了定位跟踪（Cancer Lett., 2002, 188, 59-65）。Yeung等通过化学发光成像分析方法实现了对单个酶分子的检测（Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 2603-2606）。作为检测肿瘤标志物的一种重要分析方法，化学发光成像分析法将为肿瘤的早期诊断以及预后的监测起到更为重要的作用。为满足肿瘤细胞临床分析的检测要求，如何提高检测的灵敏度和特异性，发展新的分析方法仍是研究者不断努力的方向。化学发光成像分析技术的发展趋势在于合成新的发光标记物和标记技术；在新的分析原理上力求创新，追踪生命科学和环境科学发展的前沿领域，建立新的检测方法，促进生命科学、环境科学的研究和发展。

核酸适体（aptamer）是采用指数富集配体系统进化法（SELEX），从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到的能高亲和性、高特异性地与靶标分子折叠形成特定三维结构的单链寡核苷酸的体外筛选技术。自上世纪九十年代初美国L. Gold和J. Szostak两个研究组最早发展起这项新技术以来，SELEX技术得到了迅猛发展，筛选的靶标分子已由最初的单一物质发展到完整的动物细胞、细菌病原体等复杂靶标。以完整细胞为靶标的SELEX技术可以在筛选细胞上特定靶分子未知的情况下进行筛选，进一步通过核酸化学进行制备、修饰及生物功能化，可实现对生物大分子、细胞等生物靶标的选择性检测、定位及其生物功能的调控，为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来新的思路和方法。核酸适体仿生分子识别体系在生物医学领域具有的潜在优势在于：核酸仿生分子识别体系的分子探针不但具有类似抗体的分子识别性能，与靶标结合的特异性和亲合力与抗体相当甚至更强；具有很好的稳定性，可大规模批量生产；与传感及成像技术的结合十分方便，非常适合于癌症早期诊断，可解决对多靶标的动态跟踪、比对和对靶标分子浓度、分布的动态成像等关键问题；而且由于这些分子探针的制备不需要免疫动物或细胞，可按不同需要实现从生物分子到细胞、组织的分子识别；更重要的是使用仿生分子识别体系可直接获得病变组织、细胞的特征分子指纹，揭示癌症的发生与发展机制、发现新型癌症标志物，为癌症的诊治提供重要资源。随着对核酸适体研究的深入，尤其是纳米生物探针与其相结合应用，该技术将在肿瘤诊断治疗及微生物检测领域具有更为广泛的应用前景。

尽管目前核酸适体仿生分子识别体系的研究在国际、国内均受到广泛重视，相关研究进展不断出现，但是与生物分子识别的研究相比，核酸适体仿生分子识别体系的研究仍处于起步阶段，核酸适体仿生分子识别体系与生物医学等诸多领域的对接与整合几乎还是空白。

发明内容   

本发明以血小板衍生因子（PDGF-BB）为研究对象，利用核酸适体与其特异性识别作用，采用化学发光成像技术建立PDGF-BB核酸适体传感器，可代替目前采用单克隆抗体捕获目标物进行疾病检测的双抗体夹心酶联免疫分析法（ELISA），具有灵敏度高，选择性好。制备简单，易于保存等优点。

本发明提供一种PDGF-BB含量的检测方法，包括以下步骤：

（1）采用链霉亲和素包被微孔板，并用封闭溶液封闭，制备固相载体。

优选的，链霉亲和素包被液浓度为2 μg/ml，由0.05 M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释制得。