[发明专利]一种高效表达生产内吗啡肽2的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，涉及内吗啡肽2的高效表达生产及其应用，具体涉及具有生物学活性的内吗啡肽2的大量表达和高效外分泌至细胞外，及其在制备治疗慢性疼痛和癌痛药物中的应用。

背景技术

慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一，其生理学特点是痛觉的反应性增高，主要表现为痛觉过敏(hyperalgesia)和超敏反应(allodynia)。此类疼痛治疗困难，主要是由于其机制不明。目前在治疗上，主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂，但存在众多的副作用以及成瘾、耐受等反应，从而限制了其长期使用。

内吗啡肽-2是阿片μ受体高亲和力和高选择性的内源性配体，是真正的“内源性吗啡”，其镇痛效能同吗啡相近。目前，慢性疼痛的药物治疗效果不佳，而用基因治疗的方法来处理，利用外源性载体介导内吗啡肽-2蛋白直接或间接作用于神经元，比化学药物或蛋白制剂的纯度高、副作用少、耐受发生率低，且可利用载体表达的特异性和长期性，解决临床上长期用药带来的问题（参见：Pohl M，Braz J.Gene therapy of pain:emerging strategies and future directions.Eur J Pharmacol，2001，19，429(1-3):39-48）。

内吗啡肽-2的生产需要解决两个关键问题，一是所表达的内吗啡肽-2必须具有生物学活性，有良好的治疗效果，而且表达的量要足够大，二是所表达的内吗啡肽-2必须分泌到细胞外，而且分泌的效率要足够高，才能大量结合到目标部位。但目前，内吗啡肽-2的基因还未克隆出来，我们前期利用其氨基酸序列逆推导mRNA序列，与小鼠神经生长因子前导肽（一种可实现外分泌表达的多肽）构成融合基因，成功解决了上述的两个问题，得到了可外分泌表达的内吗啡肽-2（参见：吴飞翔，俞卫锋等．重组小鼠神经生长因子前导肽和人内吗啡肽-2融合基因腺病毒载体的构建与鉴定.第二军医大学学报，2007，11（28）：1269-1271）。

只有将信号肽从“整体蛋白”(信号肽段及内吗啡肽-2)上剪切下来，所表达的内吗啡肽-2才能成为具有活性的成熟蛋白，这一技术需要实验的证实。为了达到高效分泌的目的，我们前期利用另外一种内源性阿片肽：β-内啡肽作为靶基因，比较了人源性的神经生长因子前导肽和小鼠神经生长因子前导肽的外分泌效率，发现人源性的神经生长因子前导肽对β-内啡肽外分泌效率更高。（参见：Xu XW,Pei SJ,Miao XR,Yu WF.Human signal peptide had advantage over mouse in secretory expression.Histochem Cell Biol2009;132:239-46）。

目前，国内外尚未见利用人源性的神经生长因子前导肽实现对内吗啡肽-2的高效分泌的相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达生产内吗啡肽2的方法，本发明的另一目的在于提供该方法所得表达产物内吗啡肽2在制备治疗慢性疼痛和癌痛药物中的应用。

本发明从人类基因组获取人源神经生长因子信号肽序列，并在此基础上将内吗啡肽2的表达序列与之相连，同时在接点处添加了Furin水解酶的识别序列，从而形成了能够分泌表达内吗啡肽2的融合基因。在对人源神经生长因子信号肽序列、Furin水解酶识别序列、内吗啡肽2序列进行研究，得出一个生产及外分泌内吗啡肽2的基因序列。

本发明的第一方面，提供了一种高效表达生产内吗啡肽2的方法，其具体步骤为：

(a)设计并合成一个含有人源神经生长因子信号肽序列和内吗啡肽2表达序列的融合基因，该融合基因的序列如SEQ ID NO:1所示；

(b)将(a)所述的融合基因序列插入一表达载体，使该融合基因序列处于表达载体启动子的控制之下，通过PCR扩增，筛选出阳性重组子，构建表达载体；

(c)将(b)所构建的表达载体转化宿主细胞，诱导培养内吗啡肽2的外分泌表达；

(d)收集表达产物内吗啡肽2，并采用硅胶柱层析法纯化内吗啡肽2。

所述步骤(b)中的表达载体可以是腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒、腺相关病毒载体或质粒。

所述步骤(b)中的PCR扩增，引物序列为：

正向序列：5’-CTAGAGCCTCTGCTAACCATGGTC-3’（SEQ ID NO:2）；