[发明专利]检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测幽门螺杆菌的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行幽门螺杆菌检测的方法和试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP），能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的细菌中唯一的I类致癌因子。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为59%。HP的感染给患者造成极大的痛苦，加重医疗负担。由于HP的分离培养技术十分复杂，不宜在实际检测中推广。目前主要用于HP的诊断有¹³C（或¹⁴C）尿素呼气法、快速尿素酶法和血清法。其中¹³C（或¹⁴C）尿素呼气法受到了广泛的应用，但其存在一定的假阳性，因为其他分解尿素的细菌也呈阳性反应。快速尿素酶法的缺点也是存在假阳性。血清学检测的缺点是不能反应患者当时感染的状态。

荧光PCR作为一种新的检测方法，其在病原微生物检测中得到了广泛的应用。国外最早有人将这种方法运用在HP的检测中，主要靶基因为尿素酶A（ureA）和HP的cag毒力岛A（cagA）。然而，这两种检测方法都未能应用到实际中，原因是这两个基因在不同的HP菌株间保守性不够强，或者由于保守序列太短而不能得到灵敏度高的引物和探针。另一个最主要的问题是HP菌株相互之间存在地域性差异，因此依据国外的菌株所设计出的引物和探针不能应用到我国HP感染的检测中。目前，NCBI数据库中，尚缺乏大量的中国来源HP菌株的序列，因此不能通过对比找到适合中国菌株的特异保守的序列。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测幽门螺杆菌的特异性靶序列；本发明还在于提供上述靶序列的用途，以提高对中国流行的幽门螺杆菌的检测能力。

为实现上述目的，通过对本实验室收集的来自中国不同地区（分别为北京、陕西、浙江和云南）的74株HP菌株的cag毒力岛的全长（约40kb）进行了测序，通过vector6软件对比，找到了cag毒力岛第六段基因，即位于cagH的一段完全保守序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶序列是检测幽门螺杆菌的遗传标记物。根据报道中国HP菌株99%以上含有cag毒力岛。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测幽门螺杆菌的遗传标记物。

本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。可以使用诸如Primer Express Version3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物适用于国内幽门螺杆菌扩增检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

HPcagH-FP:5’-TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’，

HPcagH-RP:5’-CGCTTC TCA AATGATACTTAATCAATC-3’。

探针序列为：

(FAM)5’-AGGTGCTAGTAGCTAATC-3’(BHQ1)。

本发明提供一种幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立物模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于38的标本为阳性结果；

Ct值大于40的标本为阴性性结果；

Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：

本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，55～65℃退火30s，45个循环。

本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。