[发明专利]一种柑橘黄龙病快速诊断方法

说明书

技术领域：

本发明属于柑橘病害防治领域，具体涉及一种柑橘黄龙病快速诊断方法。

背景技术：

我国是世界上的柑橘生产大国；柑橘产业是我国农业支柱产业，在农业经济中占有极其重要的地位，在促进农民增收、增加社会就业和社会主义新农村建设中发挥极其重要的作用。柑橘病虫害是柑橘产业发展的重大障碍，其中最严重的是被称为柑橘“癌症”的柑橘黄龙病。随着柑橘生产的快速发展，柑橘黄龙病的发生和为害越来越严重。该病是一种为害极大的传染性病害，其流行持续时间长、发病范围广、发病率高，造成我国大部分地区柑橘寿命短、产量低、生产成本高，每年经济损失高达数十亿美元，严重困扰和制约我国乃至世界范围内柑橘产业的发展。

研究结果已证明，田间的黄龙病病菌主要是由柑橘木虱传播的。因此，防治柑橘木虱，减少田间柑橘木虱的种群数量，成为控制黄龙病的核心问题。广东省昆虫研究所在柑橘木虱和柑橘黄龙病方面进行了比较深入的研究，并申请发明专利“一种柑橘园控制柑橘木虱和黄龙病的方法”，申请号：201310049098.6。

然而，目前黄龙病防治面临的主要问题是难度大，技术要求高，实施较困难。其问题的关键是由于检测诊断技术跟不上，种植户不认为自己的柑橘树染上黄龙病，所以也就不积极去采取措施。因此，快速准备易操作的检测诊断技术，成为黄龙病防治的急需的技术难点。

目前，检测诊断技术主要田间症状诊断及指示植物鉴别、电镜检测诊断、免疫学检测诊断、核酸分子检测诊断、基于淀粉碘反应的诊断方法（张利平，2009），其中PCR技术是目前的主流技术（邓晓玲等，1999；王中康等，2004；孟祥春等，2007）。基于淀粉碘反应的诊断方法来源于Schneider(1968)发现黄龙病感染的叶片中淀粉含量很高，2002年Masatoshi Onuki用组织学方法证实了感染黄龙病的柑橘叶片积累大量的淀粉粒。Le Thi Thu Hong和Nguyen Thi Ngoc Truc（2003）随后建立了碘反应诊断黄龙病技术，技术要点为：（1）采集黄龙病特征的叶片，采集时不要采集内膛叶、卷叶、嫩叶，采集时间为早晨，不要采集枝、果和根。（2）取1g的叶片，与2ml蒸馏水混合，研碎。（3）滴加2μL叶和水的混合液在反应膜上(NCM，NitroCellulose Membrane)，5分钟后，滴加2μL碘液在反应膜的样品上。（4）观察叶片颜色变化，等待结果，阴性反应颜色不变，阳性则变蓝。日本TAKUSHI(2007)测定感染黄龙病的柑橘叶片中淀粉含量是400-500mg/kg，正常叶片为85.6mg/kg，并建立快速诊断技术，他们用砂纸擦刮叶片表面20下，然后将砂纸放在塑料袋中，向袋内加25μL的碘液显色。马来西亚的Lily Eng（2007）用不同的砂纸重复了上述方法。我国张利平等（2009）重复该技术，磨碎采集的柑橘感病材料，加等量的纯水，然后吸取4μL叶片和水混合液于反应膜上，等5分钟，滴加等量的碘溶液，观察颜色变化，试验结果与PCR结果一致性可以达到93.3%。

本发明人通过研究发现：目前淀粉显色技术之所以没有广泛应用是因为以下原因，（1）由于早晨采样，没有真正消除正常叶淀粉的影响。正常叶进行光合作用积累淀粉，有时由于环境因素，晚上可能不能完全转移，导致早晨正常叶中有淀粉残留；（2）由于上述技术没有去掉叶绿素，显色时存在干扰，也可能影响检测诊断准确率；（3）上述诊断技术中需要与水混合进行研磨，而淀粉是不溶于水的，与水混合进行显色反应，准确性易受影响。

发明内容：

本发明的目的是提供一种简便快速，准确性高的柑橘黄龙病快速诊断方法。

本发明的柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、暗处理：用黑色袋子套住待检测的柑橘的叶片，封口，暗处理12-24小时，得到暗处理后的叶片；或者采集待检测的柑橘的枝条，带回室内，插在水中，再用黑色袋子套住叶片或放在暗室中，暗处理12-24小时，收集叶片得到暗处理后的叶片；或者在日出之前，去采集过夜的待检测的柑橘的叶片作为暗处理后的叶片；