[发明专利]哈氏弧菌外膜蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是哈氏弧菌外膜蛋白及其应用。

背景技术

哈氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，具有发光特性，能运动，短杆状，是世界范围内养殖动物疾病的主要病原菌之一。它可以以游离状态存在于海水中，也可以存在于海洋动物的肠道，能够引起大范围海洋种类致病，包括脊椎动物和无脊椎动物。在鱼类中，哈氏弧菌可以感染大范围的硬骨鱼，包括锯盖鱼、澳洲肺鱼、大菱鲆、遮目鱼、黄花鱼、鲶鱼等。在中国，哈氏弧菌能够引起养殖牙鲆致病并引起严重的死亡。

常见报道的鱼类疫苗有几种，包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗。亚单位疫苗因其接种剂量小、免疫原性强、抗体出现早、滴度高、持续时间长和毒副作用小等优点而得到关注。外膜蛋白位于病原菌的表面，能够刺激宿主的免疫细胞对其进行识别。重组的外膜蛋白能够保持天然的免疫原性，刺激鱼体后产生特异性抗体，对病原菌的感染产生一定的免疫保护效率，某些还能够显著的增强宿主吞噬细胞的吞噬活性，因此逐步成为鱼类亚单位疫苗研究的热点。

发明内容

本发明目的在于提供哈氏弧菌外膜蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种哈氏弧菌外膜蛋白，外膜蛋白为序列表SEQ ID No.1或No.2中的氨基酸序列所示。

哈氏弧菌外膜蛋白的制备方法，以哈氏弧菌T4为模板，分别采用173F/173R和214F/214R为引物对进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pEASY-E2连接，所得连接液分别转化入大肠杆菌DH5α中，筛选质粒分别为pOMP173和pOMP214；

将上述质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID No.1或No.2中的氨基酸序列所示的重组蛋白；

所述引物为173F：5’-GATATCATGCAACTGAACAAGGTTC-3’；173R：5’-GATATCGTATACTAGAACCGCACG-3’；214F：5’-CCCGGGATGAAAAAAACAATCAGCA-3’；214R：5’-CCCGGGGAACTTGTAACCGCCG-3’。

哈氏弧菌外膜蛋白的应用，所述哈氏弧菌外膜蛋白可作为哈氏弧菌疫苗的疫苗蛋白。

所述哈氏弧菌外膜蛋白与佐剂混配可作为哈氏弧菌疫苗。

所述哈氏弧菌外膜蛋白与佐剂按体积比为1:1。

本发明具有如下优点：本发明的哈氏弧菌外膜蛋白作为疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率皆大于70%。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的外膜蛋白。泳道1，分子量标准；泳道2,OMP173；泳道3，OMP214。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001）；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

本发明的外膜蛋白OMP173和OMP214分别为序列表SEQ ID No.1和No.2中的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No.1为：

MQLNKVLKGLLIAIPVMAMTACSSSDDAASNTGAETNTGAAETTVVTPIDQNGQLTEQELKEQALRETQTIYFAFDNSTIAGDYEEMLAAHASYLSKNPALKVTIEGHADERGTPEYNIALGERRAEAVSNYLQALGVQADQISIVSYGEEKPLLLGQSEEVYAKNRRAVLVY

（a）序列特征：

●长度：173

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：哈氏弧菌T4