[发明专利]一种培养人脐带间充质干细胞的方法

权利要求书

1. 一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

    （1）取新鲜采集的人脐带，清洗，放入脐带保护液中2-8℃保存备用，所述的脐带保护液是在AIM-V培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素得到的，其中青霉素钠和硫酸链霉素在脐带保护液中的终浓度分别为100-200 U/mL和100-200 U /mL；

   （2）取浸泡在脐带保护液中不超过48小时的人脐带，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用；

   （3）将无菌清洗过的人脐带剪成肉糜状，加入AIM-V培养基，置分离管中用全自动组织分离器进行分离，得脐带组织匀浆；

   （4）将全自动组织分离器处理好的脐带组织匀浆进行离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基，置于36-38℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂孵育箱中培养，至观察到瓶壁上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得人脐带间充质干细胞原代细胞混合液，然后经离心，即可获得人脐带间充质干细胞原代细胞，再经传代培养至细胞融合度达80-90%即得。

2. 根据权利要求1所述的培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的脐带保护液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素预先溶解后再加入到AIM-V培养基（治疗级)中得到的；所述步骤（2）中青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素按一定量加入0.9%氯化钠注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液的配制是将注射用两性霉素B先用0.9%氯化钠注射液溶解后，再和特定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人脐带在青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗时间均为8-12min。

3. 根据权利要求1所述的培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）和步骤（2）中的清洗均为0.9%氯化钠注射液清洗。

4. 根据权利要求1所述的培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的步骤（4）为培养5-6天后，取出未贴壁的上层置另一新培养瓶中，向原培养瓶和新培养瓶中均加入无血清培养基继续培养，并每隔3-4天换液一次，待培养10-15天后即可获得人脐带间充质干细胞原代细胞；

然后将原培养瓶和新培养瓶中的培养基完全移出，往原培养瓶和新培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液浸没贴壁细胞，放入36～38℃培养箱保温消化7-9分钟，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，离心弃上清，吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞/cm²接种到培养瓶中，并向培养瓶中补充无血清培养基，置36～38℃、饱和湿度，体积分数为5%的CO₂孵育箱中培养，每3-4天全量换液一次，至贴壁细胞彼此融合，且融合度达80-90%，即得人脐带间充质干细胞，在有需要时，可重复上述操作进行多代细胞培养扩增。

5. 根据权利要求1所述的培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述T25培养瓶可放置不超过5g的人脐带经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T75培养瓶可放置 10-15 g的人脐带经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T175培养瓶可放置30-35 g的人脐带经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；

所述T25培养瓶中需要的无血清培养基的体积为6-8mL；所述T75培养瓶中需要的无血清培养基的体积为20-25mL；所述T175培养瓶中需要的无血清培养基的体积为30-35mL。