[发明专利]胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：每15μl待测标本中加入的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的组份及份数如下：

3.根据权利要求1或2所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的GLP-1受体的制备步骤如下：

⑴真核细胞GLP-1受体表达

①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII 酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；上游引物序列见序列SEQ NO.1，下游引物序列见序列SEQ NO.2；

②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：

94℃，30 s；

60℃，20 s；

72℃，90 s；

25个循环后，72℃延伸7min；

③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段，分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI 和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+) (5.4kb)；

④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入E.coli DH5α细菌中；

⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入E.coli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；

⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，将该细胞株液氮冻存备用；

⑵ 提取表达GLP-1受体细胞膜的过程 

① 向步骤⑴中细胞株中加入harvesting 缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液得沉淀；

② 将沉淀重新悬浮，再将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；

③ 将步骤②中细胞液离心，沉淀即为GLP-1受体。

4.根据权利要求1或2所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：

余量为双蒸水；

pH=7.4。

5.根据权利要求1或2所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：

余量为双蒸水；

pH=7.4。

6.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至5任一项所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。

7.一种利用胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：在检测过程中使用如权利要求1至5任一项所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂。

8.根据权利要求7所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：步骤如下：

⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本、磷酸西他列汀、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、3-异丁基 1-甲基黄嘌呤、牛血清白蛋白及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；

⑵将上述反应体系110微升加入包被羊抗人cAMP多克隆抗体的微孔板中，于室温下反应30分钟；

⑶弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入生物素标记的鼠抗人cAMP单克隆抗体100微升，充分混匀后于37℃孵育1小时；

⑷弃去上述液体，加入洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶100微升，于37℃孵育30分钟；

⑸弃去上述液体，加入PBS洗液350微升/孔洗板3-5次后，加入显示底物100微升，15分钟后加入终止液100微升终止反应；

⑹以标准品测定的OD值为纵坐标，GLP-1浓度为横坐标绘制标准曲线，通过标准曲线获得未知样品浓度，对胰高血糖素样肽-1生物学活性进行检测。