[发明专利]一种酪氨酸酶电化学生物传感器及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器，涉及一种基于有序介孔碳(GMC)-四氧化三钴(Co₃O₄)-壳聚糖(Chi)复合材料的酪氨酸酶(Tyr)电化学生物传感器用于检测水体环境中酚类化合物的方法。

背景技术

酚类化合物作为化工合成的基础原料在工业生产中被广泛应用，主要来自农药、杀虫剂、塑料和药物等化学品的生产。这些酚类化合物被排入到水体中会产生严重的水体环境污染，并具有致癌、致畸、致突变等潜在毒性，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。酚类化合物因其高毒性引起世界各国的高度重视，上个世纪70年代，美国就将11种酚类化合物列入129种环境优先控制污染物之中。中国也在上个世纪80年代将6中酚类化合物纳入优控污染物的行列。

为了预防酚类污染物的危害，能够及时准确的测定环境(特别是水体)中酚类化合物的浓度水平显得尤为重要。目前常用的酚类化合物分析检测方法有：分光光度法、色谱法和色谱-质谱联用法等。这些方法存在着所使用的仪器价格昂贵，仪器操作繁琐，需要专业的科研人员进行测定，样品的前处理过程繁琐等缺点。因此急需发展一种简便、快速、灵敏、价格低廉的酚类化合物检测方法，来满足水体环境中快速现场检测的需求。电化学生物传感器这一新兴的分析手段能够弥补上述缺点，满足快速现场检测的需求。

生物传感器是一种精密的分析器件，它结合一种生物或生物衍生敏感元件与一只理化换能器，能够产生间断或连续的数字电信号，信号强度与被分析物成正比。从1956年Clark首次提出酶电极概念以来，经过数十年的发展，生物传感器技术已广泛应用在环境监测、食品分析、医疗保健、医药和军事医学等方面。酶电化学生物传感器利用酶分子作为响应元件，依靠电化学信号的变化来指示检测结果，具有以下几个方面的优势：1.酶对催化反应底物酚类化合物具有专一性，酶传感器选择性较好；2.电化学检测响应时间短，分析快速；3.传感器可以长期储存，多次使用；4.传感器易于小型化，适合现场检测。

酶的固定对生物传感器的性能起着至关重要的作用。近年来，纳米材料作为酶固定材料越来越受到关注。纳米材料有着比表面积大，导电性好，生物相容性强等优点，这些优点能够有效的提升酶生物传感器的性能。有序介孔碳是一类新兴的碳基纳米材料，它具有有序的孔结构，孔容量大，比表面积大，孔直径可调等优点。当介孔碳的孔尺寸正好和酶分子的大小相当，介孔碳就可以为酶分子提供一个具有保护能力的微环境来阻止酶失活，解决酶生物传感器酶分子泄露和酶分子失活的难题。此外，纳米结构的金属氧化物可以增强酶与金属氧化物之间的直接电子传递，缩短传感器的响应时间、增强传感器的响应强度。为了进一步提高生物传感器的灵敏性和稳定性，将介孔碳和四氧化三钴通过简单物理混合得到介孔碳-四氧化三钴纳米复合材料，再利用成膜剂壳聚糖将由纳米复合材料固定的酪氨酸酶修饰在玻碳电极表面，期望构建性能更加优异的酶生物传感器。

迄今为止，国内外上还没有基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖复合材料制备的酪氨酸酶电化学生物传感器用于检测酚类化合物。所以发明一种灵敏度高、检测限低、稳定性好、价格低廉、方法简单的用于检测酚类化合物的生物传感器是一个亟待解决的技术难题，本发明有望成为用于现场检测环境水样中酚类污染物的一个有力工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，这种传感器具有高灵敏度、低检测限、高选择性、可靠便携、价格低廉、易于小型化和具有长期的存储稳定性等优点，并且能够用于现场检测环境污染物尤其是水体中酚类化合物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

构建基于介孔碳-四氧化三钴-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，并利用该传感器通过电化学检测信号前后的变化对水体中的酚类化合物进行测定。

酪氨酸酶电化学传感器的制备与样品的检测过程具体步骤如下：

(1)将介孔碳材料与酪氨酸酶磷酸缓冲盐溶液混合，在室温下震荡1小时。

(2)将四氧化三钴加入到上述介孔碳酪氨酸酶混合溶液中，在室温下震荡0.5小时。

(3)将成膜能力和粘着力极强的壳聚糖加入到介孔碳、酶分子和四氧化三钴形成的复合材料溶液中混匀，取4μL上述含有介孔碳-酪氨酸酶-四氧化三钴-壳聚糖复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干。

(4)将一定浓度的待检测酚类化合物水溶液滴加到缓冲溶液中，利用电化学工作站进行电化学扫描并记录响应信号。

本发明的有益效果如下：