[发明专利]一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用DNA熔解温度分析水稻Pita基因的功能标记开发。

背景技术

水稻是我国重要的农作物，其产量的稳定性直接关系到国计民生。稻瘟病是水稻的毁灭性病害，对水稻的产量造成重大影响，高抗稻瘟病一直是水稻新品种培育的关键目标。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育携带抗病基因的品种，这就需要对抗病基因的准确高效鉴定。传统的稻瘟病抗性检测，是通过人工剪叶然后接种稻瘟病菌的方式鉴定，该方法检测结果稳定性较差、周期较长、技术条件要求高，无法满足在育种低世代大群体的鉴定要求。最有效的抗性鉴定方法，应是直接对稻瘟病抗性基因进行选择。

    研究表明，Pita基因与水稻稻瘟病抗性相关。Pita基因位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，定位于BAC克隆BAC142E8上。Pita基因包含2个外显子和1个1463bp 的内含子，编码一个长度为928 个氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含NBS结构域和富亮氨酸结构域(LRD)，Pita位点上的抗感两基因的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基酸由抗病产物的丙氨酸变异为感病产物的丝氨酸，其抗病机制是Pita基因的编码产物能与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发抗病反应。根据Pita基因第918氨基酸的G/T变异，王忠华等设计了半显性标记YL155/YL87、YL183/YL87区分抗病基因Pita和感病基因pita，抗病基因利用YL155/YL87可扩增出1.2kb的片段，而YL183/YL87无法扩增出片段。但是，由于这一功能标记需两次聚丙烯酰胺凝胶电泳后方能判别基因型，成本较高、操作较繁杂，使其难以得到普遍应用。

    成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展分子辅助选择育种的重要基础。DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如Pita和pita两种等位基因在第918氨基酸的G/T变异，将导致该DNA区段Pita比pita的熔解温度高1℃。如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免凝胶电泳的缺陷，实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。

发明内容

为了解决背景技术的技术问题，本发明提供一种稻瘟病抗性基因功能标记Pita-G/T，所述的Pita-G/T由两对引物Pita-G/T-out、Pita-G/T-in构成，引物序列如下：

    Pita-G/T-out：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:1 CCCAGGTTACAACTTACAAGGA；反向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:2 CTCTG AAGAC GTGAA GAGGA TT，

Pita-G/T-in：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:3 CTTCT TTCTT TCTCT GCCGT GG；反向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:4 TCATC AAGTC AGGTT GAAGA TGC。

    根据需求提供该区别稻瘟病抗性基因功能标记Pita-G/T的应用，所述的应用为区分稻瘟病抗性基因与稻瘟病感病基因。

    并根据实际的需要，提供一种区分稻瘟病抗性基因Pita与稻瘟病感病基因pita的方法，包括以下步骤：

S1. 以待测基因组DNA为模版，利用根据权利要求1所述的Pita-G/T-out扩增；

S2. 将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用根据权利要求1所述的Pita-G/T-in扩增；

S3. 利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.8~79.3℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在77.8~78.3℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻。

本发明通过研究发现稻瘟病抗性基因Pita的熔解温度为79.1，稻瘟病感病基因pita的熔解温度为78.1，稻瘟病抗性基因Pita的熔解温度比等位基因pita的熔解温度高了1℃，所以，通过熔解温度就可以区分Pita和pita序列差异，从而判别水稻材料的基因型（抗病或感病）。如果待测水稻的DNA的熔解温度在78.8~79.3℃之间，可判断待测水稻为抗稻瘟病水稻；如果待测DNA的熔解温度在77.8~78.3℃之间，可判断待测水稻为感稻瘟病水稻。