[发明专利]一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用DNA熔解温度分析水稻稻瘟病抗性基因的功能标记开发。

背景技术

水稻是我国重要的农作物，其产量的稳定性直接关系到国计民生。稻瘟病是水稻的毁灭性病害，对水稻的产量造成重大影响，高抗稻瘟病一直是水稻新品种培育的关键目标。提高稻瘟病抗性最有效的方法是培育携带抗病基因的品种，这就需要对抗病基因的准确高效鉴定。传统的稻瘟病抗性检测，是通过人工剪叶然后接种稻瘟病菌的方式鉴定，该方法检测结果稳定性较差、周期较长、技术条件要求高，无法满足在育种低世代大群体的鉴定要求。最有效的抗性鉴定方法，应是直接对稻瘟病抗性基因进行选择。

    研究表明，稻瘟病抗性基因Pik位于11染色体长臂，对许多中国稻瘟病小种有较强的、稳定的抗性。Pik基因座位两个连续的NBS-LRR类基因（Pik-1和Pik-2）组成，两个基因对Pik介导的稻瘟病抗性均必不可少。Pik座位上已定位或克隆的抗性复等位基因包括Pik(供体Kusabue)、Pikh(供体Tetep)、Pik-H4(供体H4)、Pikp(供体K60)、Pikm(供体Tsuyuake)、Piks(供体Norin)、Pi1(供体LAC23)等。尽管Pik座位的不同抗性复等位基因之间的抗谱有所差别，但抗性都较好。Pik对应日本晴（含稻瘟病感病基因pik）基因组的两个基因分别为LOC_Os11g46200（pikm5-NP）和LOC_Os11g46210（pikm6-NP），其中Pik-2在不同等位基因之间相对较保守。以已克隆的多个抗性复等位基因的Pik-2和LOC_Os11g46210进行多重序列比对，发现在抗性复等位基因与日本晴pik在第2173位碱基处存在SNP变异，其中抗性基因为T，而感病基因为C。针对该位点，目前并未报道合适的分子标记，只能利用基因测序的手段分析基因型。基因测序技术环节复杂、成本高，很显然并不适合大规模育种群体的筛选。

    成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展分子辅助选择育种的重要基础。DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如Pik和pik两种等位基因在第2173位的T/C变异，将导致该DNA区段Pik比pik的熔解温度低1℃。如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免基因测序的缺陷，实现对大规模育种群体的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。

发明内容

为了解决背景技术的技术问题，本发明提供一种稻瘟病抗性基因功能标记Pik-C/T，所述的Pik-C/T由两对引物Pik-C/T-out、Pik-C/T-in构成，引物序列如下：

    Pik-C/T-out：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:1 CAATGCCAGCACTCGAAATCAT；反向引物序列（5’-3’） 为SEQ ID NO:2 CAGTGACGATGCCATCAACAAA，

Pik-C/T-in：正向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:3 TGAAAATCTCCGTGAGGTGCAT；反向引物序列（5’-3’）为SEQ ID NO:4 TTGGTTATTGCTTCTGCCCCAT。

    根据需求提供该区别稻瘟病抗性基因功能标记Pik-C/T的应用，所述的应用为区分稻瘟病抗性基因与稻瘟病感病基因。

    并根据实际的需要，提供一种区分稻瘟病抗性基因Pik与稻瘟病感病基因pik的方法，包括以下步骤：

S1. 以待测基因组DNA为模版，利用根据权利要求1所述的Pik-C/T-out扩增；

S2. 将步骤S1扩增所得的基因组稀释，并以之为模版，利用根据权利要求1所述的Pik-C/T-in扩增；

S3. 利用仪器检测步骤S2扩增所获的DNA的熔解温度，如果待测DNA的熔解温度在78.5~79.1℃之间，待测水稻为抗稻瘟病水稻，如果待测DNA的熔解温度在79.5~80.1℃之间，待测水稻为感稻瘟病水稻。