[发明专利]一种多重荧光PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种登革热、基孔肯亚和黄热病毒的多重荧光PCR检测用引物及探针，其特征在于，所述引物和探针的组成如下：

登革热病毒上游引物：5’-TGGGAGAGACCAGAGATCCTG-3’

登革热病毒下游引物：5’-ATTCAACAGCACCATTCCATTTTC-3’

登革热病毒探针：5’-荧光报告基团-TCTCTACAGCATCATT-荧光淬灭基团-3’

基孔肯亚病毒上游引物:5’-ACGAGGCAAGTTGTCTATTATGAG-3’

基孔肯亚病毒下游引物:5’-GGTAGAGCGTTGACCCTACTG-3’

基孔肯亚病毒探针:5’-荧光报告基团-AACAGCACACGGTCGCACGGTT-荧光淬灭基团-3’

黄热病毒上游引物:5’-TGCTAAGCTGTGAGGCAGTG-3’

黄热病毒下游引物:5’-CTAGACCCCGTCTTTCTACCAC-3’

黄热病毒探针:5’-荧光报告基团-ACAGCCGACCTCCAGGTTGCGA-荧光淬灭基团-3’。

2.一种登革热、基孔肯亚和黄热病毒多重PCR检测试剂盒，包含多重荧光PCR检测混合液，所述多重荧光PCR检测混合液中含有权利要求1所述的引物和探针。

3.如权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重荧光PCR检测混合液还含有RT-PCR MIX和H₂O。

4.如权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重荧光PCR检测混合液的组成为：登革热病毒上游引物0.5μl/test；登革热病毒下游引物0.5μl/test；登革热病毒探针0.1μl/test；基孔肯亚病毒上游引物0.5μl/test；基孔肯亚病毒下游引物0.5μl/test；基孔肯亚病毒探针0.1μl/test；黄热病毒上游引物0.5μl/test；黄热病毒下游引物0.5μl/test；黄热病毒探针0.1μl/test；RT-PCR MIX12.5μl/test；双蒸水3.2μl/test。

5.如权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒还含有RT-PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。

6.如权利要求5所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括含有SEQ ID NO:10所示目的扩增序列的登革热病毒质粒，含有SEQ ID NO:11所示目的扩增序列的基孔肯亚病毒质粒，以及含有SEQ ID NO:12所示目的扩增序列的黄热病毒质粒；所述有阴性对照为DEPC-H₂O。

7.如权利要求5所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，登革热、基孔肯亚和黄热病毒检测试剂盒荧光PCR法的PCR检测体系如下：

多重荧光PCR检测混合液        19μl

RT-PCR酶                     1μl

待测品                       5μl

反应总体系为25μl。

8.如权利要求7所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述待测品为样本核酸提取液、阳性对照品或阴性对照品。

9.权利要求2-8任一权利要求所述登革热、基孔肯亚和黄热病毒多重PCR检测试剂盒的非诊断目的的使用方法，步骤如下：

1）样本核酸提取液的制备；

2）试剂制备：配置多重荧光PCR检测混合液，并向其中加入RT-PCR酶，振荡、离心，获得反应混合液；

3）加样：将步骤2）的反应混合液置于PCR管中，将样本核酸提取液、阳性对照品、阴性对照品分别加入装有反应混合液的不同PCR管，获得样本反应管、阴性对照反应管、阳性反应管；

4）PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置扩增程序，进行PCR扩增；

5）PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，荧光通道选用FAM、HEX以及Cal Red 610通道。

10.如权利要求9所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤4）所述扩增程序为：45℃10min；95℃ 15min；95℃ 15sec和60℃ 60sec交替循环40次。

11.权利要求1所述登革热、基孔肯亚和黄热病毒的多重荧光PCR检测用引物及探针，权利要求2-8任一权利要求所述登革热、基孔肯亚和黄热病毒多重PCR检测试剂盒在制备登革热、基孔肯亚病和/或黄热病检测试剂中的应用。