[发明专利]一种角鲨烯的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种角鲨烯的生产方法，即一种角鲨烯的生物合成方法，以及构建的重组菌株。

技术背景

角鲨烯是一种脂质不皂化物，最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Sqμalene，其化学名称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质。

作为角鲨烯主要来源的深海鲨鱼鱼肝油，需要捕杀大量深海鲨鱼才能获得，由此便引来一系列问题，如成本高，大量无节制地捕杀鲨鱼使得鲨鱼数量减少，鲨鱼病原体感染导致病原体感染人类，没有一个严格的生产标准等。随着科技的发展，从橄榄油等植物中提取角鲨烯也是目前获得角鲨烯的另一工艺方法。但是单位高成本的问题并没有解决，使得角鲨烯的价格居高不下，导致角鲨烯和角鲨烷(角鲨烯的全氢化衍生物)目前只是小规模市场应用，如手表润滑剂、药品/营养品、化妆品、香水和高价产品的化学中间体。因此，寻求一种生物合成角鲨烯的方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种角鲨烯的生产方法，即一种将角鲨烯合成酶基因进行克隆并在大肠杆菌中共表达，从而构建了能合成角鲨烯的重组菌株，弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种角鲨烯的生物合成方法，包括下列步骤：

1）构建携带有角鲨烯合成酶基因的表达载体；

2）以大肠杆菌为宿主菌株，转化步骤1）得到的表达载体，获得重组表达角鲨烯合成酶的大肠杆菌工程菌；

3）发酵培养上述步骤2）得到的大肠杆菌工程菌，生产角鲨烯。

其中的角鲨烯合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种生产角鲨烯的大肠杆菌工程菌，为大肠杆菌BL21-SQS（Escherichia coli BL21-SQS），已于2013年6月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013246。

本发明提供的角鲨烯的生产方法简单、高效，构建得到的大肠杆菌工程菌能高产角鲨烯，可广泛应用于角鲨烯的发酵生产，提高角鲨烯产量，从而有利于角鲨烯的大规模应用。

附图说明

图1：本发明使用的SQS-pET28a(+)质粒的遗传图谱。

图2：BL21-SQS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图。

其中：泳道1为BL21-pET28a(+)（阴性对照）菌体胞内蛋白；泳道2为BL21-SQS菌体胞内蛋白；箭头所指条带为角鲨烯合成酶。

图3：BL21-SQS菌体胞内代谢产物HPLC分析图谱。

其中：A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内代谢产物分析图谱；箭头所指的峰表明菌体胞内代谢产物中含有角鲨烯。

图4：BL21-SQS菌体胞内代谢产物MS质谱分析图谱。

其中：A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内目标产物分析图谱；箭头所指的峰表明目标产物为角鲨烯。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1角鲨烯合成酶表达载体的构建

为了使角鲨烯合成酶基因能够更高效的在大肠杆菌中进行转录，首先对印度人参基因组中角鲨烯合成酶基因GenBank Accession NO.GΜ732820的密码子进行了优化，经过长期的研究后获得了核苷酸序列为SEQ ID NO:2的角鲨烯合成酶基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。序列为SEQ ID NO:2的基因核苷酸片段由上海英潍捷基生物科技有限公司合成作为扩增的模板。

设计基因片段两边酶切位点BamHI和EcoRI。分别利用引物F：