[发明专利]一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段及其应用，属于基因工程、酶工程、生物医药领域。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxy proline, Hyp) 不属于常见20种氨基酸，是脯氨酸羟基化修饰的结果，羟基通常加在第4或是第3位碳上。由于有两个不对称的碳原子，所以羟脯氨酸有4种立体异构体。分别为反式-4-羟基-L-脯氨酸，顺式-4-羟基-L-脯氨酸，反式-3-羟基-L-脯氨酸和顺式-3-羟基-L-脯氨酸。

反式-4-羟基-L-脯氨酸在哺乳动物细胞中主要存在于胶原蛋白中，对形成稳定的三股螺旋胶原蛋白具十分重要的作用，可使结缔组织的弹性和韧性得到加强（Shibasaki, T. Mori, H. ozaki, A. 2000）。体液羟脯氨酸平衡失调会造成许多疾病，例如营养不良，老年痴呆症，牙齿、骨骼中的软骨和韧带组织的韧性减弱以及组织纤维化疾病等（Rajesh N. Kalaria, Andrea B. Pax . 1995）。

近年来，羟脯氨酸的研究和开发已引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。在医药方面，由于其具有多种生理功能与独特的生物活性，可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，治疗各种皮肤疾病。反式-4-羟基-L-脯氨酸易于衍生化，药理活性多样，近年来逐渐被应用到医药原料药手性中间体领域，用于合成新一代培南类抗生素、抗肿瘤、 抗高血压及新型胃药等多种新创制药物的合成。由于其具有抗氧化、抗辐射的作用，在美容业方面，可以作为化妆品添加剂。目前，世界用量为500吨/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趋势。

目前，我国反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产主要采用化学水解提取工艺，以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程制备， “三废”排放量大、污染严重，能耗高、纯度低及生产成本高。因此，利用节能、污染少的生物催化法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸势在必行。

生物转化法是指利用细菌或真菌细胞中的酶将底物分子转化为功能产物的过程。反式-4-羟基-L-脯氨酸生物转化法是指利用L-脯氨酸为底物，在Fe²⁺、α-酮戊二酸和L-抗坏血酸存在的条件下，利用反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因（GenBank ID：D78338.1）长816核苷酸，编码272个氨基酸残基，GC含量为66.67%，研究发现，该酶蛋白主要以包涵体形式出现（Christian Kleina，Wolfgang Huttela. 2011）。这种酶最早发现于链霉菌属 P-8648菌株中（Sheehan,J.C., H.G.Zachau, and Lawson. 1958）。日本协和发酵公司经过菌株的大量筛选，从自然界中筛选到一株具有反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶活性的孢囊菌属菌株，并且利用此菌株反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因，构建了L-羟脯氨酸生物合成工程菌，进一步提高了L-羟脯氨酸的产量，专利号为：ZL94115662.1。随后，日本科学家利用该菌株中的反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因，根据宿主菌的偏好性和密码子的兼并性对该基因进行了密码子的同义突变，构建了不同表达载体进行酶的表达和活性检测研究，发现含有串联双色氨酸启动子的表达载体酶活性最高，催化L-脯氨酸转化成反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化效率可高达87%。但他们构建的表达载体不是常见载体，构建过程十分的繁琐，转化过程是直接将底物加到培养中的大肠杆菌工程菌培养基中，培养基成分复杂，不易于后续的分离纯化，在工业化利用方面存在一定缺陷性。2010年，德国科学家利用pET-28a作为载体，利用GroEL/GroES伴因子来提高酶的可溶性，转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力是61%，转化效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段，可用于高效转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。较全长酶，该基因片段编码酶活性高，转化效率高，转化反应时间短，具有较好的工业应用前景。

本发明还提供所述基因片段的表达产物以及含有所述表达产物的工程菌的构建方法。

本发明还提供了所述基因片段的应用。

本发明实现上述目的采用的技术方案：

本发明提供的编码高活性反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶的基因片段核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。