[发明专利]一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域和植物遗传工程学领域，具体涉及一种来源于人苍白杆菌的EPSP合酶基因及其在转基因植株中的应用。

背景技术

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate）是一种有机磷除草剂。20世纪70年代初由孟山都公司开发，通常使用时一般将其制成异丙胺盐或钠盐。其异丙胺盐是著名除草剂商标“Roundup”的活性成分。

草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，是全世界使用量最大的除草剂之一。草甘膦的除草性能优异，极易被植物叶片吸收并传导至植物全身，对一年生及多年生杂草都有很高的活性。但是该除草剂是一种非选择性除草剂，对农作物同样具备杀伤力。为使在农作物生产中更广泛的使用草甘膦，必须培育出具有抗草甘膦抗性或降解性的农作物。

草甘膦的毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS，简称EPSP合成酶）的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等生物合成过程中的一个关键酶。草甘膦可以通过植物的韧皮部进行运输，并与EPSP合成酶结合，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，引起细胞死亡。

草甘膦也能抑制大部分细菌中芳香族氨基酸的生物合成中EPSP合成酶活性，但是已发现部分细菌的EPSPS对草甘膦具有抗性，并且被克隆获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。例如农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp CP4)和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用（美国专利453590,4769061,5094945）。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。

随着生物信息学的发展，可以从细菌全基因组数据库中发现许多EPSPS基因，但是这些EPSPS基因并不能直接提供抗草甘膦基因。这是因为，一种细菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高低，是不能通过EPSPS的氨基酸序列预测的，而需要对它们进行抗草甘膦功能验证，由于EPSPS数量众多，功能验证工作量巨大。但是已知序列的EPSPS基因，为抗性基因的克隆提供了更加简单的方法。

我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的EPSPS，从而获得转基因抗草甘膦植物。

本发明从污泥中筛选到一株具有草甘膦抗性的细菌，利用其基因组序列的信息克隆了其EPSPS基因，并且进一步在拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等植物中证明了这个EPSPS基因的抗草甘膦能力及其在发展转基因抗草甘膦农作物中的用途，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供新的使植物具有草甘膦抗性的基因及其编码蛋白。另外，本发明还提供了这个基因的基因工程中间体（如，表达盒、载体和细胞等），获得具有草甘膦抗性的植物的方法和应用，并提供了判断植物是否具有草甘膦抗性的鉴定方法。

具体而言，在第一方面，本发明提供一种对草甘膦具有高抗性的新基因，是发明人筛选并克隆到的一种新的EPSP合酶基因（以下称为O-EPSP合酶基因），O-EPSP合成酶基因是从一株高草甘膦抗性菌株人苍白杆菌（Ochrobactrum anthropi KT-CGL-7-7）中克隆得到的。Ochrobactrum anthropi KT-CGL-7-7为本发明人从喷洒草甘膦的试验田土壤中经初筛和复筛等大量的实验得到的对草甘膦具有高耐受活性的菌株。该菌种已于2012年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No. 6230。O-EPSP合酶基因是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2）与SEQ ID NO：1序列具有90％以上相似性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3）与SEQ ID NO：1相比，具有SEQ ID NO：1序列的部分、区段和/或片段（包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失）、其变体、突变体、嵌合体和融合物且可编码赋予高草甘膦抗性活性的蛋白质的核苷酸序列；