[发明专利]利用重组毕赤酵母生产蛋白A的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到一种利用重组毕赤酵母生产蛋白A的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus aureus Protein A,SPA)是某些种类的金黄色葡萄球菌的细胞壁结合蛋白，该蛋白是由丹麦科学家Klaus Jensen于上个世纪五十年代研究金黄色葡萄球菌细胞壁结构时发现的。其基本结构由以下三部分构成，即信号肽，抗体结合功能区和细胞壁结合区。蛋白A的抗体结合功能区包含E、D、A、B、C五个同源单结构域，每个单结构域都能与免疫球蛋白G(IgG)单独作用。该蛋白对IgG的结合主要是基于对IgG的Fc区特异性的结合能力。正是因为蛋白A与人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白具有特异性结合能力，因此被广泛用作免疫学试剂(与多种报告分子偶联后用于组织化学、Western、ELISA等的抗体检测)；与固相载体相连，用于抗体的分离纯化；临床上用于治疗抗体相关性疾病的血液净化吸附剂等。

由于蛋白A的用途广泛，因此有很大的市场需求量。蛋白A在研究之初是从金黄色葡萄球菌中直接提取的天然蛋白，该种获取蛋白A的方法存在着很多弊端。首先，蛋白A只占金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白的6.7%，并且该蛋白为细胞壁结合蛋白，通过胞壁肽聚糖以共价键与细胞壁结合，分离纯化过程需要通过酶解消化使蛋白A与细胞壁分离，造成了蛋白Ａ提取的复杂性增高；其次，金黄色葡萄球菌为致病菌，大规模生产危险性较大。而且蛋白Ａ广泛用于抗体类药物的制备和血液净化，如果分离纯化过程中产生病原菌物质的残留，则会在人体内产生严重的免疫反应。因此近年来，人们开始转向采用基因工程的方法来生产重组蛋白A，寻求大规模生产蛋白A安全有效的方法。

目前，蛋白A的表达主要是利用大肠杆菌表达系统。大肠杆菌因其具有构建相对简单，生长周期短，易于培养等优点，成为研究相对成熟的表达宿主。蛋白A于八十年代被首次克隆并于大肠杆菌中表达。美国Repligen公司于1982年申请了关于利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白A的专利(US5151350)，采用金黄色葡萄球菌蛋白A的原序列，将其构建到载体pAc37中，表达宿主采用的是E.coli MS371。其后，该公司又申报了名为“Nucleic acids encoding recombinant protein A”的专利(US7691608)，涉及到的重组蛋白A带有一部分细胞壁结合域(X)和全部功能区。Donald Colbert等(Donald Colbert,AlgisAnilionis,Pal Gelep,et al.Molecular organization of the protein A gene and its expression in recombinant host organisms.J BiolRespModif.1984.3:255‐259.)分别利用大肠杆菌MS371和酵母LL20表达重组蛋白A。但均为胞内表达，没有表达量的测定和培养条件的优化。国内申报的专利有6项，均采用了蛋白A单结构域反复串联，然后在重组大肠杆菌中进行表达(CN1432578A，CN1524957A，CN101050464A，CN101298476A，CN101298475A，CN101337986A)。

细胞内蛋白种类多，数量大，给重组蛋白A的分离纯化带来困难。基因工程产品的分离纯化成本往往占产品总成本的60‐70%，并且分离纯化的产品纯度直接关系到最终产品质量，因此利于分离纯化的表达体系是降低生产成本，提高产品质量的关键。

对于蛋白A的纯化工艺，目前应用较多的主要有一步亲和层析法和多步纯化法。前者主要应用于实验室规模，后者主要是基于Repligen公司所申请的相关专利内容，被应用于多数大规模生产当中。

由于蛋白A可与IgG分子相互作用，所以早期的蛋白A纯化途径就是利用IgG亲和层析的方法。该方法早在1972年即被提出，1982年Repligen公司所生产的rSPA也是利用此种方法进行纯化，目前国内的多数相关报道也是利用IgG亲和纯化的方法。IgG亲和层析仅需一步操作便可使SPA纯度达95%以上，操作简便。但是，IgG作为生物大分子，稳定性差，清洗过程中易从载体上脱落对产品造成污染，同时也降低了层析柱的循环使用效率和使用寿命，增加了生产成本。IgG分子空间位阻大，单位载体偶联配基密度低，加之偶联过程中蛋白固定化的空间取向不一致，进一步增加空间位阻，大大降低了层析柱动态载量，难以大规模应用。