[发明专利]一种乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法

权利要求书

1.一种乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：    

（1）酶液的制备：取待鉴定的甘草种子，在自来水中浸泡6-8小时，在室温下置于器皿中，保持湿润令其发芽，待胚根长到1-1.5cm时，按照1g样品加入1ml电极缓冲液研磨，在0-4℃下，以10000转/分钟，离心10分钟，上清液即为SOD提取液；所述的电极缓冲液指的是pH 8.3的电极缓冲液；

（2）制凝胶板：将玻璃板洗净放好封胶条，装入电泳槽，插入楔板；然后灌胶：先灌分离胶，用水封住，待出现界限后，吸干水封，再灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后，拔去梳子，去掉封胶条，重新装好电泳槽；

其中分离胶与浓缩胶的配制如下：

（3）点样与电泳 ：取步骤1的上清液30微升，加入相应的泳道中；然后先用100v电压，电泳20分钟，待溴酚蓝指示剂走出浓缩胶后改为140V电压，电泳1小时10分钟，待溴酚蓝指示剂即将走出凝胶板时停止电泳，取出凝胶板，进行SOD同工酶染色；

（4）SOD同工酶染色方法：电泳结束后，取出凝胶板，在黑暗条件下用2.45×10^-3mol/L NBT溶液浸泡20分钟，然后再在核黄素溶液中，在黑暗条件下浸泡15分钟，最后浸泡在EDTA—Na₂ pH7.8的磷酸缓冲液，用200W白炽灯照光，至背景显出蓝色或者紫褐色，同时出现无色透明条带为止，立刻照相或保存于8%乙酸中，即可得待测样品的SOD同工酶酶谱；

（5）品种确认：若待测种子的SOD同工酶酶谱与标准酶谱左侧两泳道相同，即为乌拉尔甘草种子，若与右侧两泳道相同即为胀果甘草种子。

2.权利要求1所述乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法，其中所述的分离胶、浓缩胶的配制如下：

     （1）30%丙烯酰胺：取丙烯酰胺29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，溶解于去离子水中， 定容至100ml；

    （2）pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：取Tris 18.17g，加入25ml 1mol/L盐酸，加水至100ml；

（3）pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl缓冲液：取Tris 6.0g，加48ml 1mol/L盐酸，加水至100ml；

   （4）pH 8.3的电极缓冲液：取Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，加水定容到500ml，用时加水稀释10倍；

（5）10%过硫酸铵：取1g过硫酸铵溶于10 ml去离子水中即成。

3.权利要求1所述乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法，其中步骤（4）所述的SOD同工酶染色方法所用到的溶液配制如下：

（1）2.45×10^-3mol/L NBT溶液：称取0.2gNBT溶于100ml0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液；

（2）核黄素—TEMED溶液：称取核黄素0.0011g，用0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液溶解，再加0.4ml TEMED，最后用缓冲液定容至100ml；

（3）反应缓冲液：称取EDTA—Na₂ 0.0372g，溶于100ml 0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液。

4.权利要求1所述乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法，其中所述的甘草种子若是硬实种子先用98%浓硫酸浸泡30分钟，然后用清水冲洗净表面的硫酸再使用。

5.权利要求1所述乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法，其中所述的保持湿润令其发芽指的是：将种子放在铺有浸湿滤纸的培养皿内，盖上皿盖，每天两次加水使滤纸始终保持湿润状态。

6.权利要求1所述乌拉尔甘草与胀果甘草种子的鉴定方法在用于区别和鉴定乌拉尔甘草与胀果甘草种子方面的应用。