[发明专利]检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白NS3和NS5的天然双特异性抗体的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测抗丙型肝炎病毒编码的非结构蛋白NS3和NS5的天然双特异性抗体的试剂盒，属于临床检验学领域。

背景技术

通常所描述的一个抗体（antibody）分子具有两个相同的抗原结合区域（Fab），只能识别一种抗原。双特异性抗体（bispecific antibody）是一类具有双功能的抗体分子，其两个Fab段具有不同的特异性，能与不同的抗原分子结合。目前应用于医学领域的双特异性抗体均是通过人工改造相应的单特异性抗体而获得。荷兰Schuurman等人首次报道了一种存在于人体内的天然双特异性抗体―IgG4。报道称，他们成功证实了分离的IgG4组分具有结合两种不同过敏原的特性。他们对IgG4的双特异性作出如下推断：IgG4在体内是动态性分子，一种特异性的IgG4半分子（一条轻链连同相应的重链）可以与另一种特异性的IgG4半分子发生交换，由此产生的杂交分子即具有同时结合两种抗原的特性。

天然的双特异性抗体可能普遍存在于长期受免疫原刺激的疾病，例如自身免疫疾病，细菌、病毒或者寄生虫感染，以及慢性肿瘤生长等过程。丙型肝炎病毒（HCV）感染是一种病毒在宿主肝细胞内不断复制的慢性感染过程，通常不能被治愈。HCV编码4个结构蛋白（core,E1,E2,ion channel p7）和6个非结构蛋白（NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,和NS5B。研究表明，HCV编码的core,NS3,NS4B和NS5A是慢性丙型肝炎感染中引起体液免疫应答的主要抗原。慢性丙型肝炎病人血清中极有可能存在针对HCV病毒不同抗原的天然双特异性抗体。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种检测HCV编码的NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒。该试剂盒基于酶联免疫吸附检测技术，利用双抗原夹心法，包括HCV NS3和NS5两种抗原，可以检测存在于丙型肝炎患者血清中的一种天然双特异性抗体，所述的双特异性抗体可同时结合HCV NS3和NS5两种抗原，是丙型肝炎检测的一项新型指标。

本发明要解决的第二个技术问题是提供检测抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒在检测丙型肝炎患者血清中抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种检测抗HCV NS3和NS5双特异性抗体的试剂盒，包括：NS3包被的微孔板、生物素标记的NS5（NS5-biotin）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、底物液、洗涤液和终止液。

本发明所述的NS3和NS5两种抗原包括但不限于已经公开报道的，和根据已公开的NS3序列（Genbank:ADN30215.1）和NS5序列（Genbank:AAQ85803.1）利用现有技术手段制备的重组蛋白或合成的多肽。优选地，本发明所述的NS3为重组蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1所示，所述的NS5为合成多肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。

所述Streptavidin-HRP购自Thermo Fisher Scientific公司。

所述试剂盒中的稀释液为含20%（v/v）小牛血清的磷酸盐缓冲液，洗涤液为含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液，底物液为3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺（TMB），所述终止液为0.5M硫酸。

所述阳性对照液为已确定双特异性抗体为阳性的丙型肝炎患者血清，阴性对照液为健康人血清。

利用本发明所述的试剂盒检测抗NS3和抗NS5双特异性抗体的方法为：

（1）包被有NS3的微孔板捕获血清样本中具有NS3反应性的抗体；

（2）加入生物素标记的NS5结合具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体。

（3）加入HRP标记的链霉亲和素检测具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体。

本发明人采用NS3包被微孔板作为固相抗原，经与血清样本温育后，加入生物素标记的NS5结合具有抗NS3和抗NS5双特异性的抗体，最后加入HRP标记的链霉亲和素检测检测捕获的双特异性抗体。使用PIERCE公司的Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit试剂盒将NS5生物素化，用丙型肝炎抗体阳性血清对NS5-biotin进行稀释度测定，确定的最佳稀释度用于双特异性抗体的测定。

本发明的优点：