[发明专利]一种木聚糖酶重组表达工程菌

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种木聚糖酶重组表达工程菌。

技术背景

木聚糖（xylan）是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，其含量仅次于纤维素，是第二丰富的多聚糖。在被子植物中木聚糖占干物质重的15%-30%，在裸子植物中占干物质重的7%-12%。木聚糖在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，具有很强的抗营养作用，因而大大限制了富含木聚糖饲料（大麦、小麦、黑麦等）的应用。木聚糖酶（Xylanase）是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶。研究表明，添加木聚糖酶可以提高麦类及杂粕类等非常规饲料的饲料转化率，促进养分消化吸收，维持肠道微生态以及降低污染。

迄今为止，关于酸性木聚糖酶的报道比较少，大多数木聚糖酶的最适作用pH值在6-7。酸性木聚糖酶（pH4.0以下时仍保持较高酶活性）已经引起人们的广泛关注。而酸性木聚糖酶在饲料行业中的应用，可以有效地破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在我国，对嗜酸木聚糖酶的研究很少，运用基因工程手段产业化生产嗜酸木聚糖酶产品还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程技术手段，将烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株；能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有较高活性，同时具有很强耐热性和胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受性。

本发明用于重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，为巴斯德毕赤酵母H43（Pichia pastoris H43），已于2013年6月6日，保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2013252。

所述的木聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

用于编码上述木聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的毕赤酵母工程菌用于生产木聚糖酶，其重组表达的木聚糖酶在酸性条件下适用。

本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效重组表达木聚糖酶，发酵酶活能达到10000U/ml；其表达的木聚糖酶在酸性范围内具有较高的酶活性，最适pH值为5.0，在pH4.0-5.5的范围内能保持80%以上的活性；具有很强的耐热性，最适反应温度为50℃，在温度35-60℃的范围内，能保持50%以上的活性，85℃处理2min、5min后，酶活残留率为50%、48%；对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有很强的耐受性，用胃蛋白酶处理2h后，酶活残留率为68%，胰蛋白酶处理6h后，酶活残留率为87%，因此可广泛应用于食品、饲料添加剂等领域。

附图说明

图1：木聚糖酶基因XynH43的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图2：构建的重组表达载体pPIC9K-XynH43的过程示意图。

图3：毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳图，箭头所示为重组木聚糖酶XYNH43。

图4：重组表达的木聚糖酶XYNH43的发酵曲线图。

图5：重组表达的木聚糖酶XYNH43的pH特性分析。

图6：重组表达的木聚糖酶XYNH43的反应温度分析。

图7：重组表达的木聚糖酶XYNH43的耐热性分析。

图8：重组木聚糖酶XYNH43的蛋白耐受性分析。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1、烟曲霉木聚糖酶基因的克隆

查阅GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶11家族中的一个木聚糖酶基因，该基因来源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus），GenBank号为70985696。通过上海捷瑞生物工程有限公司合成该木聚糖酶基因，命名为XynH43，合成基因的基因序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。