[发明专利]焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物

说明书

技术领域

本发明涉及基因甲基化检测领域，尤其涉及一种焦磷酸测序法定量检测DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物。

背景技术

DNA甲基化是目前表观遗传学研究的热点，它是在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基供体（-CH₃，S-腺苷甲硫氨酸）加到胞嘧啶上的一种化学修饰过程。在DNA甲基化与肿瘤关系的研究中，发现癌基因多为低甲基化，导致其重新开放或异常表达；抑癌基因多为超甲基化，其表达往往受抑制。因此，DNA甲基化与癌症关系密切，对DNA甲基化的研究不仅可为揭示肿瘤发生机制提供重要依据，而且可能为肿瘤的发生提供有效的预测标记。

DMBT1基因位于10号染色体长臂，由高度同源的重复外显子和内含子序列构成，该基因具有至少54个外显子，并且覆盖长达8kb的基因组区域。大量研究显示DMBT1基因转录和／或表达的异常与神经系统肿瘤、消化系统肿瘤、肺癌、乳腺癌等均有关。DMBT1基因在许多恶性肿瘤中常表现为表达缺失或下调，故其被认为是一个候选的抑癌基因。

目前，单个基因DNA甲基化检测方法有：

（1）甲基化特异性PCR（MS-PCR），DNA在亚硫酸盐作用后，分别用一对甲基化引物和一对非甲基化引物进行PCR扩增，产物跑胶后定性分析是否出现甲基化。

（2）亚硫酸氢盐测序PCR（BSP），经过亚硫酸盐处理后，设计引物进行PCR扩增获得目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。该方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到测序，要得到准确的结果需挑取大量克隆，操作繁琐。

（3）甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM），通过熔解曲线分析可以将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，因此DNA样本经过亚硫酸盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现。但该方法只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。

（4）联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA），DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，进行PCR扩增；扩增产物经纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。该方法最大的优点就是相对简单，可进行快速定量，且需要的样本量少。然而，它的局限性也十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，且阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

（5）焦磷酸测序(Pyrosequencing)，Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种三磷酸脱氧核糖核酸(dNTP)，若该dNTP与模板配对，DNA聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔量的焦磷酸基团(PPi)。PPi最终转化为可见光信号，出现一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。该方法根据序列延伸过程中C和T的掺入量来定量确定单个CpG位点的C-T比例，能够快速地检测甲基化的频率，由于技术限制扩增的片段较短(约60bp)，所以引物设计是实验成功的关键。

发明内容

本发明提供了一种焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物，利用该引物可以准确检测人DMBT1基因特异性位点的甲基化水平。

一种焦磷酸测序法定量检测人DMBT1基因特异性位点甲基化水平的引物，包括PCR引物和测序引物，

其中，所述PCR引物的正向引物序列为：

5’-GTTGTGGAATTAGTGTGAGATTTAGAA-3’，

反向引物序列为：

biotin-5’-AAATAATTTTTCCTAACAAAACATACTCTC-3’；

所述测序引物序列为：

5’-AAAGTTATTATGGATTTATGGT-3’。

本发明利用Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip kit甲基化芯片筛查六价铬暴露人群与对照人群基因组DNA甲基化谱之间的差异，发现六价铬暴露人群的基因组DNA中，DMBT1基因启动子区一个位点（该位点在上述甲基化芯片中的编号为：CG17976473）的甲基化水平明显高于对照人群。

由于甲基化芯片的筛测结果时有偏差，为检验该筛测结果的正确性，本发明采用焦磷酸测序对该位点的甲基化水平进行检测。检测方法包括如下步骤：

（1）提取人基因组DNA，对所述人基因组DNA进行重亚硫酸盐转化；