[发明专利]肠道病毒71基因修饰系统的建立及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肠道病毒71型基因修饰系统的建立及其突变株应用，特别涉及一种在野生型肠道病毒71型安徽分离株1基础上进行突变后得到的肠道病毒71型突变株。

背景技术

肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。自20世纪70年代发现肠道病毒71型，已有3次EV71引起的大范围手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）流行，每次都有死亡病例的发生。EV71病毒在学龄前儿童特别是5岁以下年龄组发病率最高，除引发一般的手足口病的临床症状外，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，给家庭和社会造成了沉重负担。

由于近年来手足口疾病疫情的持续暴发，因此，开展EV71病毒致病机制的研究和研制稳定、高效的EV-71病毒疫苗，一直是目前该研究领域的热点和重点。

目前，尚未有利用痘苗病毒载体反向遗传学技术研究EV71病毒的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道病毒71型突变株及其应用。

本发明所提供的肠道病毒71型突变株，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA中编码2C蛋白的第25位氨基酸Ile的密码子替换为编码Val的密码子后得到的重组病毒。

在本发明中，所述编码Val的密码子具体为GUG。

在本发明的一个实施例中，所述野生型肠道病毒71型具体为肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）。

所述肠道病毒71型安徽分离株1（Anhui1-09-China）的基因组RNA反转录的cDNA序列为GenBank号为GQ994988.1的序列。

在本发明的一个实施例中，所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第45-7439位，即为将GenBank号为GQ994988.1的序列的第4148-4150位的AUC替换为GUG后得到的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种制备所述肠道病毒71型突变株的方法。

本发明所提供的制备所述肠道病毒71型突变株的方法具体可包括如下步骤：

（a）将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有所述肠道病毒71型突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段；

（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；

（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述肠道病毒71型突变株。

在上述方法中，所述野生型痘苗病毒具体可为野生型痘苗病毒WR株。

进一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1的序列。

在上述方法中，步骤（a）中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列（Up date：2012-11-22）的第80267-80725位和第80726-81194位（对应序列1的第1-459位和第460-928位）的序列。