[发明专利]一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺。 

背景技术

随着重组DNA技术的问世，培养基已被广泛用于多种细胞培养，包括动物、植物和细菌。生物制药工业中的目标产物（如抗体）可以通过在液体培养基中培养细胞而大量生产。这些细胞为天然的或者工程化的，利用生物反应器在液体培养基中快速成倍增长，并生产目标产物。这些产物可以直接从培养基中收集，也可以从收获的细胞中提取获得。 

培养基提供细胞培养过程中所需的营养物质，在早期的细胞培养过程中，培养基配方以血液的化学组成和物理化学性质为基础（如渗透压、pH值等），被简称为“生理性的解决方案”。但是，不同类型的细胞在不同的培养环境中对于氧气/二氧化碳分压、营养物、维生素和微量元素的需求有所不同，因此，培养基的配方取决于特定的细胞要求。一般而言，培养基的主要成分包括氨基酸、有机盐、无机盐、维生素、微量金属、糖类、脂质和核酸等，各组分的浓度根据给定细胞的特定要求而相应调整。 

目前在单克隆抗体生产或基因重组蛋白的生产中，动物细胞的培养多数采用特异的低血清或无血清培养基。无血清培养基可通过在标准的基础 培养基（如RPMI1640(Moore et al.(1993)In Vitro Cell Dev.Biol.29A:265-267)；Iscove'smodifiedEaglesMedium(IMDM);Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM)等）中添加营养物或者用某种功能成分取代血清获得，也可以通过在基础培养基中补充微量金属元素和接近等压水平的盐（如主要的阳离子钾、钠、钙、镁等）来获得（Barnes,D.,and Sato,G.(1980)Cell22:649-655;Cleveland,W.L.,et al(1983)J Immunol Meth56:221-234;Iscove,N.,and Melchers,F.(1978)J Exp Med147:923-933;Kawamoto,T.,et al(1983)Analytical Biochemistry130:445-453;Wolpe,S.D.,In Vitro Immunization and Growth of Hybridomas in Serum-Free Medium,inJ.P.Mather,ed.,Mammalian Cell Culture,Plenum Press,New York,1984）。此外，完全无蛋白成分的培养基也已被开发出来（Fik et al.(1991)BioPharm.March,pp.26-29）。 

经过几十年的发展，哺乳动物细胞培养基大致经历了从有血清培养基，动物蛋白水解物培养基，植物蛋白水解物培养基到无血清、化学成分确定培养基（Chemically-defined Media）4个阶段。出于对疯牛病毒（TSE）及其他各类动物病毒引起的生物安全性的考虑，培养基要尽量避免使用动物源的成分。典型的无血清或化学成分确定培养基含有50-70种成分，包括氨基酸、维生素、微量元素和生长因子等。向培养基中添加动物或植物的蛋白水解物可以有效地提高细胞生长密度、延长细胞活性，从而提高抗体表达量。常见的动物细胞培养的蛋白水解物来源有大豆、酵母和小麦等，但由于其成分的复杂性和批次间的质量变化,添加蛋白水解物可能会造成培养基批次间不稳定从而影响培养过程和产品质量。化学成分确定培养基则全部由化学结构明确的小分子化合物构成。目前，虽然国际上已经普遍使用化学成分确定培养基进行生物制药，但由于生产成本高，国内还普遍使用血清和蛋白水解物做为提高目标产物产量的手段。 

多种细胞株可用来生产单克隆抗体或基因重组蛋白。通常宿主细胞的选择依赖于产物的特性。例如，高糖化的重组蛋白通常采用真核宿主细胞生产。常用的真核细胞株有中国仓鼠卵巢细胞（CHO），幼鼠肾细胞（BHK），转化的人胚胎肾细胞（HEK-293）和鼠杂交瘤细胞（如NS0和SP2/0）。而细菌细胞如大肠杆菌和芽孢杆菌多用来生产非糖基化的多肽。 

不同类型的细胞通常需要不同的营养元素和生长因子，因此许多个性化的培养基已被开发来满足不同细胞的需要。目前已开发的多种真核细胞培养基已被阐述（Ham and McKeehan Meth.Enz.,58:44(1979))；Bottenstein et al.,Meth.Enz.,58:94(1979)）。同时商业化规模发酵已成功用于制备人重组多肽药物（如抗体）。