[发明专利]一种GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生物、化学工程技术领域，具体地涉及一种具有人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)活性的GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。

背景技术

1929年，Zunz和Labbare将-类从肠道中分离出来的、可以促进葡萄糖刺激胰岛素分泌的体液因子命名为肠降糖素(incretin)，GLP-1是其中的主要成分。GLP-1是由肠道L细胞分泌的胰高血糖素前原基因的产物，其在食物摄入后分泌。体内主要存在两种生物活性形式：GLP-1(7～36)amide和GLP-1(7～37)，GLP-1约80％的循环活性来自前者。GLP-1作为一种激素，通过刺激分泌胰岛素降低餐后血糖，同时抑制胰高血糖素的分泌。并且，其具有抑制胃肠道食物的清空和食物的摄入，此外，其能够引起胰岛β细胞的增殖。

GLP-1适用于II型糖尿病的治疗，其降低血糖的效应是血糖依赖性的，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复至正常值则不再继续发挥降糖作用，所以在用药过程中不会出现低血糖。通过长期治疗，能够有效改善II型糖尿病患者的糖化血红蛋白量，对II型糖尿病的预防和治疗具有良好的应用前景。

在实际应用中，根据以往研究结果，GLP-1进入体内后的半衰期为2min，其原因在于体内的多种蛋白酶对GLP-1的降解，目前DPP-4是其中最主要关注的酶。为抵抗此酶对GLP-1的降解，延长在体内的药效时间，已有多种方法，如氨基酸的定点突变、分子修饰等。如GLP-1衍生物CJC-1131在动物体内有效降糖时间为10～12h，其通过化学合成利用接头分子将多肽与血浆蛋白相连接并于8位替换为D-Ala而大大延长半衰期；LY315902是在GLP-1上连接1个8C脂肪链，在狗体内半衰期为3-6h；利拉鲁肽(Liraglutide)，其于GLP-1的26位的赖氨酸处连接1个16C脂肪酸侧链，并将34位突变为赖氨酸，皮下注射在人体内血浆中半衰期为12～13h；PEG修饰过的GLP-1其有效降糖时间是天然GLP-1血浆半衰期的12倍左右等等。

虽然通过对GLP-1的序列进行改造能够延长药效时间，但是由于改造后的分子与天然GLP-1的同源率低，差异较大导致不同程度的副作用，如过敏、呕吐、胃肠不适等。

现有技术中已有采用DNA重组技术制备GLP-1衍生物，名称为“一种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用”发明专利(200610024355.X)中存在以下缺点：利用大肠杆菌作为GLP-1衍生物表达的宿主菌，在后续纯化过程中，需要检测和控制大肠杆菌内毒素以及大肠杆菌DNA的残留量，增加了生产步骤和成本。

GLP-1在体内有两种形式，一种为GLP-1(7～36)amide，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者均有生物学活性。本发明涉及的GLP-1指GLP-1(7-37)，其序列如下：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。

本发明改进了GLP-1序列及结构，提出了一种GLP-1衍生物DLG3312及其固相化学合成方法。本发明提出的GLP-1衍生物DLG3312在保留良好的体内降糖活性的基础上解决了天然GLP-1体内降糖时间短的问题，其原因主要在于：本发明GLP-1衍生物DLG3312的结构X-Y-X中，X与Y的连接方式为2个X的碳端羧基分别与Y的2个氨基缩合连接，形成由2个X与1个Y构成的特定结构的为尾-尾同源二聚体。本发明中，二聚体的激动活性相对于单体有较大提高，从而能够更有效地增加胰岛素分泌的总量；二聚体中包含突变的氨基酸，同时，二聚结构就其本身而言，能阻碍与体内多种酶与其的结合，从而降低对其的降解速率；二聚体与单体相比，具有相对较大的分子量，由此相对延长因肾小球滤过作用对其清除的时间，使之在体内停留时间增加，延长药效时间。同时，本研究的DLG3312还解决了安全性问题：避免了目前所使用的多种糖尿病药物具有的副作用——造成低血糖、体重增加，引起胰岛素抵抗、胰岛β细胞衰竭等等，DLG3312具备改善胰岛素抵抗和抑制胰岛β细胞凋亡的功能，从根本改善II型糖尿病患者的糖代谢能力；此外，在成本和产品质控也体现出极大优势：本发明提出的制备方法具有生产步骤少、操作简便、成本低廉的优势，具有更大的应用潜力。

发明内容