[发明专利]一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法。

背景技术

磁珠，又称磁性微粒，是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁珠由三部分组成，核心是金属小颗粒（氧化铁、四氧化三铁），核心外均匀包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等），最外层是功能基层，具有功能基团，如氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）、羟基（-OH）等。

磁珠呈均匀球形，具有超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动达到分离目标物的目的，最外层的化学功能基团被用来与蛋白质或核酸等生物活性分子偶联。偶联后的磁珠广泛用于细胞分离与纯化、细胞分型、免疫检测、核酸分离、靶向释药系统等领域。

羧基磁珠，即最外层具有羧基功能基团（-COOH）的磁珠，是较为常用的一类磁珠。目前羧基磁珠与蛋白质的偶联方法有很多种。由于活化剂的选择、活化条件、偶联条件及偶联工艺上的差异，导致偶联蛋白质的磁珠存在偶联效率低、蛋白利用率低、偶联磁珠自身凝集、磁珠非特异吸附严重、不能通用等不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法。

本发明提供的在磁珠表面共价偶联蛋白质的方法，包括如下步骤：

（1）将磁珠与活化剂共孵育，得到活化后的磁珠；

（2）将所述活化后的磁珠与蛋白质共孵育，得到偶联有所述蛋白质的磁珠；

（3）将所述偶联有所述蛋白质的磁珠用封闭液进行处理，封闭表面的活性位点；

（4）将步骤（3）得到的磁珠边进行振荡边过筛（以除去团聚的磁微粒），收集过筛后的磁珠。

所述步骤（1）中，所述磁珠可为羧基磁珠。所述步骤（1）中，所述活化后的磁珠表面具有含N-羟基丁二酰亚胺键的化学基团。所述步骤（1）中，所述活化剂可为EDC和NHS，或所述活化剂可为EDC和Sulfo-NHS。所述步骤（1）中，所述共孵育的反应体系可为pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES缓冲液。所述步骤（1）中，所述活化剂为EDC和NHS时，所述EDC的初始浓度可为0.1-30mM，所述NHS的初始浓度可为0.3-100mM。所述步骤（1）中，所述活化剂为EDC和Sulfo-NHS时，所述EDC的初始浓度可为0.1-30mM，所述Sulfo-NHS的初始浓度可为0.3-100mM。所述步骤（1）中，所述共孵育的时间可为6-300分钟，优选为10-240分钟。所述步骤（1）中，所述共孵育的温度具体可为室温。

所述步骤（2）中，所述共孵育的反应体系可为pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES缓冲液；所述步骤（2）中，所述共孵育的条件可为：2-26℃、2-20小时。

所述步骤（3）中，所述封闭液可为含0.2-5g/100mL封闭蛋白的缓冲液，优选为含1-5g/100mL BSA的缓冲液。所述缓冲液可为MES缓冲液、PBS缓冲液或Tris缓冲液。MES缓冲液即2-（吗啉代）乙磺酸缓冲液。PBS缓冲液即磷酸盐缓冲液。Tris缓冲液即三羟甲基氨基甲烷缓冲液。所述步骤（3）中，所述“将所述偶联有所述蛋白质的磁珠用封闭液进行处理”的处理时间可为1-9小时，优选为90-180分钟。所述步骤（3）中，所述共孵育的温度具体可为室温。

所述步骤（4）中，所述过筛可为过800目-1500目筛。所述过筛具体可为过不锈钢筛网。所述不锈钢筛网具体可为304钢不锈钢筛网或316钢不锈钢筛网。所述步骤（4）中，所述过筛借助的液相体系具体可为pH4.0-7.0、0.01-0.1M的MES缓冲液。

所述方法还可包括将步骤（4）得到的过筛后的磁珠用保存液混悬后4℃保存的步骤。所述保存液为含有0.1-5g/100mL BSA和0.1g/100mL NaN₃的pH7-10、0.01-0.1MTris缓冲液。

所述步骤（2）中，所述蛋白质具体可为抗体，如羊抗异硫氰酸荧光素IgG抗体或甲状腺素单克隆抗体。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的磁珠产品。

本发明还保护所述磁珠产品在鉴定和/或分离与所述蛋白质结合的物质中的应用。所述蛋白质为抗体时，所述“与所述蛋白质结合的物质”为与所述蛋白质特异结合的抗原或二抗。

本发明具有如下优点：

（1）蛋白偶联效率高；使用双活化剂EDC和NHS活化磁珠，可以使磁珠上的活化羧基处于半稳定状态，不易水解，加入蛋白质后，与蛋白质侧链的氨基形成稳定的酰胺键，增加了磁珠和抗体的利用率，增加了偶联效率；