[发明专利]一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及紫薇属植物染色体的原位杂交方法。

背景技术

分子原位杂交（In situ hybridization，简称ISH）是把用生物素等标记物质标记的DNA片段作为探针（probe），与染色体DNA进行分子杂交，在显微镜下直接检测与探针互补的DNA片段的存在部位。通过荧光原位杂交技术将rDNA在染色体上进行物理定位，不仅可以为核型分析提供一个稳定有效的细胞学可识别的染色体标记，而且可以研究植物种属间的进化关系，阐明染色体的结构变异等重要的遗传学问题。目前，rDNA已在重要的模式作物和经济作物的基因组中进行了广泛的物理定位，为这些物种的染色体识别，基因组结构分析，物理图谱构建，以及物种亲缘关系的研究提供了直接的信息。

紫薇（Lagerstroemia indica）隶属于千屈菜科（Lythraceae）紫薇属，是我国夏季重要的观赏花木。目前，全世界紫薇属植物共有约55种，我国原产18种。该属植物多为中小染色体，且不易染色，经典的细胞学手段难于识别其染色体，限制了深入理解紫薇分子细胞遗传学机制的研究。迄今为止，关于原位杂交技术在紫薇属植物中的应用未见报道，对其基因组的结构，分子细胞遗传学领域的研究至今还是空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测紫薇属植物染色体的原位杂交方法以应用于紫薇属植物染色体的深入研究。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种紫薇属植物染色体的原位杂交方法，所述方法以紫薇属植物中期染色体作为靶DNA，以玉米45S rDNA为探针进行染色体荧光原位杂交。

具体地，所述方法包括以下步骤：

（1）染色体玻片标本的制备；

（2）探针标记；

（3）杂交前预处理；

（4）制备杂交液；

（5）探针变性与染色体变性；

（6）杂交与杂交后洗脱；

（7）信号检测。

其中，所述步骤1）以紫薇属植物茎尖为材料，采用去壁低渗火焰干燥法制备。

其中，所述步骤2）将40-60ng/μl玉米45S rDNA质粒8-10份、DIG-Nick translation mix或Biotin-Nick translation mix4份和ddH2O6-8份按体积比混合，15℃避光反应90min，加入EDTA1份，得探针标记混合液。

优选地，玉米45S rDNA质粒为10份，ddH2O为6份。

其中，所述步骤3）将步骤1）制得的染色体玻片标本干燥，经RNaseA、胃蛋白酶K处理，乙醇脱水。

其中，所述步骤4）制备杂交液的成分按体积比百分含量为50%的去离子甲酰胺，20%的50%DS溶液，20%的10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液，10%的20×SSC溶液；其中，10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液为探针标记混合液2-4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合60-65℃烘箱避光烘烤。

优选地，10mg/ml鲑鱼精溶液和探针混合液为探针标记混合液4份和10mg/ml鲑鱼精溶液4份按体积比混合60-65℃烘箱避光烘烤。

其中，步骤5）中所述探针变性为将步骤4）中得到的杂交液在94℃-96℃金属浴避光变性10min，转入冰水中处理10min，得变性探针。

优选地，95℃金属浴避光变性10min。

其中，步骤5）中所述染色体变性为制备变性液：按体积比百分含量为70%去离子甲酰胺，20%ddH2O，10%的20×SSC溶液；把变性液加到染色体制片玻片上，盖上盖玻片，83℃-85℃烘箱内避光变性3-4min，然后迅速甩掉盖玻片，-20℃下依次用70%、95%、100%乙醇脱水，每级5min，晾干。

优选地，85℃烘箱内避光变性3.5min。

其中，所述步骤6）中所述杂交为将含有探针的杂交液变性后加在染色体制片玻片上，盖上盖玻片，37℃恒温箱内黑暗培养16-18h；所述杂交后洗脱为将杂交后的染色体玻片标本依次放入2×SSC溶液，洗2×5min，放入2×SSC溶液，42℃恒温水浴10min，放入1×PBS溶液，洗5min，然后加与标记的荧光素匹配的抗体衬染。

其中，所述步骤7）为加2mg/mlDAPI荧光染液于步骤6）得到的染色体玻片标本上，染色时间5-8min，进行检测。

优选地，染色时间5min。

本发明的有益效果：