[发明专利]玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本申请涉及转基因产品的检测，特别是涉及一种玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测引物及检测方法。

背景技术

目前，转基因棉花、水稻、小麦、玉米、大豆等转基因作物越来越多，对转基因作物的检测研究也成为各国的热点。其中，转基因作物中经常使用的启动子，玉米泛素蛋白启动子(即筛选基因ubiquitin)是检测转基因作物的一个重要靶标基因。目前对玉米泛素蛋白启动子基因的检测方法主要采用常规PCR、实时荧光PCR、DNA印迹法、RNA印迹法和基因芯片法等。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展，并且检测成本高。DNA印迹法和RNA印迹法，需要转膜、杂交，操作繁琐、费用高、检测时间长，实际应用也较少。基于常规的多套PCR的基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。

变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有分辨率好、扩展性强、灵敏度高等优点。该方法在50℃条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定，样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同，从而产生不同的样品峰。具体的，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与DNA marker比较确定分子量大小，从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC，是将PCR与DHPLC相结合的技术，即先采用PCR扩增出靶标序列，然后再对扩增产物进行DHPLC分析，从而提高检测的灵敏度和特异性。目前，尚没有玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC的检测方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测的引物，以及基于该引物的玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测方法。

为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种用于玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测的引物，该引物的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-CAGAAATTGCGTGGCGGA-3’

Seq ID No.2：5’-GGGCGAGGAAGGGAAAGC-3’。

需要说明的是，本申请的引物是针对玉米泛素蛋白启动子基因而设计的特异性引物，能够对玉米泛素蛋白启动子基因进行特异性扩增，因此，可以理解，该引物除了用于本申请的PCR-DHPLC检测以外，同样适用于常规的PCR检测，以及其它的基于PCR扩增的检测，如实时荧光PCR、基因芯片等等。

本申请的另一面还公开了一种玉米泛素蛋白启动子基因的PCR-DHPLC检测方法，该检测方法包括采用本申请设计的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。

需要说明的是，本申请设计的引物是针对玉米泛素蛋白启动子基因的特异性引物，因此，可以理解，如果待检测样品中含有足量的玉米泛素蛋白启动子基因成分，即可扩增出相应的靶标片段，并在DHPLC分析时产生相应的洗脱峰。另外，本申请的引物，同时也是根据DHPLC分析的特殊需求设计的，该引物扩增出来的产物能够很好的适用于DHPLC分析。还需要说明的是，虽然本申请的引物能够从各种样品中检测出玉米泛素蛋白启动子基因从而判断出检测样品中是否含有转基因成分，但是，可以理解，这并不适用于含有玉米的样品，因为玉米种本身就含有该启动子，无从判断该启动子是玉米本身具有的还是转基因作物具有的。因此，本申请的引物和方法只可用于不含玉米成分的转基因样品检测。

进一步的，本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

优选的本申请的检测方法包括如下步骤：