[发明专利]用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及荧光定量RT-PCR检测技术，具体地说，涉及一种用于检测施马伦贝格病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针。

背景技术

2011年夏秋季节，德国和荷兰的某些牛场开始出现一种未知疾病，病牛出现发热（>40℃）、体质下降、食欲不振、厌食、腹泻和产奶量下降等临床症状，有时出现流产症状。2011年11月18日，德国弗里德里希洛弗勒研究所（Friedrich Loeffler Institute，FLI）利用宏基因组学技术（Metagenomic technique）和病毒分离技术最终确证导致此次疫情的病原体为一种新型的布尼亚病毒。因该病毒首先从德国西部城镇—施马伦贝格的一头患病奶牛血液中被分离与鉴定成功，因此根据分离地点将其暂时命名为“施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus，SBV）”，并将其引发的疫病称为“施马伦贝格病（Schmallenberg disease，SBD）”。

SBV的易感动物包括绵羊、牛（奶牛和野牛）、山羊以及马鹿（Red deer）、獐鹿（Roe deer）、羊驼（Alpaca）和欧洲盘羊（Mouflon）等反刍动物。患病牛主要出现发热（>40℃）、精神不振、体质下降、厌食、产奶量下降（最高达50%）和腹泻等临床症状，部分病牛会出现流产症状。通常情况下，成年羊不出现异常症状，但怀孕羊易出现流产、死胎或产出畸形羔羊，畸形羔羊即使分娩时尚未死亡也往往难以存活，部分发病养殖场新生羔羊畸形率高达25-50%。截至2013年4月底，正式确认存在施马伦贝格病的国家有德国、荷兰、比利时、英国、法国、意大利、卢森堡、西班牙、丹麦、爱沙尼亚、瑞士、爱尔兰、挪威、瑞典、芬兰、波兰、奥地利、斯洛文尼亚、捷克、匈牙利和土耳其，引起了欧盟（EU）、世界动物卫生组织（OIE）以及国际社会的高度重视。俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯、哈萨克斯坦、阿根廷、阿尔及利亚、摩洛哥、埃及、约旦、黎巴嫩、美国、日本和中国等众多国家已经对欧盟相关疫情国家的牛、绵羊和山羊活动物（包括胚胎）及其相关制品（包括肉类、精液和卵细胞等遗传物质）采取了不同的贸易限制措施；而智利、加拿大、塞尔维亚和瑞士等国则要求受感染国家提供更多的疫情信息和该病的有关资料，并考虑采取相关的贸易限制措施。毫无疑问，施马伦贝格病的暴发与流行已经给有关国家造成了巨大经济损失。幸运的是，截至目前尚未发现施马伦贝格病疫区内与患病动物或动物生产环境有过密切接触的人员（主要为畜主和兽医）发病的情况。尽管如此，鉴于布尼亚病毒科的多种病毒具有人畜共患的特性，因此，目前尚不能完全排除施马伦贝格病毒感染人类的可能。

现有研究结果表明，施马伦贝格病毒在分类学上属于布尼亚病毒科（Bunyaviride）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）辛波血清群（Simbu serogroup），其遗传特性与辛波血清群的沙门达病毒（Shamonda virus）、艾罗病毒（Aino virus）和赤羽病毒（Akabane virus）密切相关。基于正布尼亚病毒属病毒的N基因编码区的序列分析结果表明，SBV与沙门达病毒的同源性最高。SBV是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，病毒粒子表面有糖蛋白纤突，其基因组可分为3个节段，依次为L、M和S基因节段。其中，L基因编码RNA依赖性RNA聚合酶；M基因编码2种表面糖蛋白Gn和Gc以及1个非结构蛋白（NSm）；S基因编码核衣壳蛋白N和另一个非结构蛋白NSs。FLI研究所已经将其测得的SBV全基因序列提交到GenBank中（登录号为：L基因HE649912；M基因HE649913；S基因HE649914）。

目前，为了控制施马伦贝格病疫情在欧盟各成员国之间进一步传播与蔓延，德国FLI研究所已经建立了检测SBV血清抗体的间接免疫荧光、中和试验等血清学检测方法，利用KC细胞（杂斑库蠓幼虫细胞）和BHK-21、Vero细胞已经从患病牛血液中成功分离到了施马伦贝格病毒，为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了物质保障。

由于施马伦贝格病是一种新发的外来动物疫病，目前仅流行于欧洲，我国尚未出现相关疫情，因此国内针对该疫病尚无任何检测技术储备。鉴于布尼亚病毒科多数病毒具有人畜共患和相同传播媒介（主要为库蠓、蚊子和白蛉）的特点，目前尚不能完全排除施马伦贝格病毒能够引起人类发病的可能性。综上所述，从维持我国畜牧业持续健康发展、保障国民身体健康以及维护国家利益的角度出发，预先开展该病的检测技术储备研究已经势在必行。