[发明专利]一组用于检测斑茅多态性的引物组、检测方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及引物组，特别一组用于检测斑茅多态性的引物组及其用于检测斑茅多态性的方法及用途。

背景技术

斑茅是禾本科蔗茅属高大禾草，具有生物量大、抗逆性强、纤维素含量丰富等特点。由于其抗逆性强，能够与甘蔗进行种间杂交，常作为甘蔗育种中的优良基因来源，是甘蔗育种的主要材料之一。同时由于生物量大、纤维素含量高，已经被视为我国本土优良的生物质能源材料，其能源用潜力巨大。我国热带、亚热带地区分布大量的野生斑茅资源，搞清楚其遗传多样性规律是合理保护利用该资源的前提。在遗传多样性研究及遗传图谱构建中分子标记至关重要。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，材料间DNA水平上的多态性的直接反映。主要常用的分子标记方法有RAPD、RFLP、AFLP、SRAP、SSR等，目前斑茅遗传多样性的研究并不多，使用的标记有SRAP、ISSR、RAPD和RFLP，未见SSR标记用于斑茅的遗传多样性研究。

在研究斑茅遗传多样性中，使用了RAPD、RFLP、ISSR和SRAP等分子标记。这些标记中RAPD标记是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物，以基因组DNA作模板进行PCR扩增反应，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性,其缺点是但其重现性差；RFLP标记利用基因组DNA经特定限制性内切酶酶切后所产生相当多的大小不等的DNA片段，以同位素或生物素标记的DNA片段作探针，用杂交的方法，把与被标记的DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱，简单的说RFLP就是酶切产生的某一特异DNA片段的长度在个体间的差异，该标记的缺点是操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模；ISSR标记主要是以一条与微卫星(SSRs)序列互补的并在3’或5’端含有2-4个随机碱基的DNA序列为引物对基因组DNA进行PCR扩增的一种分子标记技术，SRAP标记利用引物设计对ORFs(open reading frames，开放阅读框架)进行扩增，上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大,这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记，ISSR标记和SRAP标记虽然一定程度上解决了以上两种标记的缺点，但是他们均为随机的显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。

发明内容

本发明专利针对斑茅基因组DNA，开发出斑茅遗传多样性研究、遗传图谱构建及分子辅助育种研究中多态性高、重复性好，标记稳定可靠，易于区分纯合基因型和杂合基因型的基因组SSR标记引物。

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。本发明一方面提供一组SSR引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列SEQ ID NO：1-30所示引物。

引物列表见表1

本发明另一方面提供上述SSR引物组在检测斑茅多态性中的应用。

本发明另一方面提供上述SSR引物组的设计方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、提取待测斑茅样品基因组DNA；

B、用酶切基因组DNA，回收并纯化,回收的产物用接头连接；

C、将连有接头的DNA片段作为模版进行扩增；

D、将步骤C中扩增产物与生物素探针进行杂交，同时用磁珠对杂交产物进行富集，构建SSR富集文库；

E、将步骤D中产物连接到载体上转入到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆进行DNA测序分析；

F、利用微卫星DNA位点查找软件对阳性克隆进行搜索，筛选出含微卫星的序列，然后用引物分析软件在微卫星两翼设计引物；

G、用不同斑茅材料对开发的SSR引物进行多态性验证。

根据本发明的具体示例，步骤B中采用内切酶，所述酶为Sau3AI酶。

根据本发明的具体示例，步骤B中酶切后进行纯化，用AxyPrep凝胶回收试剂盒回收，加接头序列缓慢退火连接。

根据本发明的具体示例，步骤C中采用接头引物扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。