[发明专利]鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物致病菌的免疫学快速检测技术领域，尤其是一种可快速检测水产动物鮰爱德华菌的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法。

背景技术

鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri) 隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，爱德华氏菌属（Edwardsiella）是引起多种鱼类产生爱德华菌病的病原菌，现已知其感染的宿主包括斑点叉尾鮰、黄颡鱼、胡子鲶、欧鲶、虹鳟、黑鲈等，具有发病急、发病率高和死亡率高等特点。目前，针对鮰爱德华菌的检测方法主要有传统的微生物学检测技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附法、细菌凝集法以及PCR技术等。上述检测方法均因操作复杂、耗时久、需要特殊的仪器设备和专业人员，而达不到快速、现场检测的目的，不适合在基层推广使用。胶体金免疫层析试纸条以其快速简便、不需特殊仪器、结果可肉眼判读、灵敏度高、特异性强等优点，已成为当今快速敏感的免疫检测技术之一，并开始逐渐应用于水产养殖业的多个领域。

胶体金免疫层析试纸条是宽度为0.3cm的试纸条，有底板，在底板上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，各部分之间重叠相接。通常在金标垫上喷涂有胶体金标记的抗体，硝酸纤维素膜上有包被抗体的检测线a和有羊抗鼠IgG构成的质控线b。其检测原理是利用吸水垫形成的毛细作用，置于样品垫上的被检测抗原首先与金标垫上的胶体金标记的抗体结合，并沿着硝酸纤维素膜（NC膜）继续向前移动，当到达固着有抗体的检测线a时，抗体将其捕获，随着反应进行，不断富集达到肉眼可见水平；过量的胶体金标记的抗体继续向前移动，到达固着有羊抗鼠IgG的质控线b时，被捕获并不断富集。因此若样品为阳性，则在检测线和质控线上均出现色条带，若样品为阴性，则仅在质控线上出现同样色彩的色条带。但是，由于迄今为止并没有适用于胶体金免疫层析试纸条的鮰爱德华菌单克隆抗体，以至于目前对于鮰爱德华菌还是采用微生物学检测技术、免疫荧光技术、酶联免疫吸附法、细菌凝集法以及PCR技术等进行检测，胶体金免疫层析试纸条并没有在检测鮰爱德华菌中得以应用。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可快速检测水产动物鮰爱德华菌的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条，有底板，在底板上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，所述金标垫上喷涂有胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被鮰爱德华菌多克隆抗体的检测线a及由羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述鮰爱德华菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。

一种上述的鮰爱德华菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

a. 制备鮰爱德华菌单克隆抗体：取保藏号为CGMCC No.7305的抗鮰爱德华菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Ei-5D11免疫小鼠，取小鼠腹水，置离心管离心后收集上清并纯化，即得鮰爱德华菌单克隆抗体；；

b. 制备胶体金：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备18~20nm胶体金溶液，并调整胶体金溶液的pH至8.2，备用；

c. 制备胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体：在电磁搅拌器下将鮰爱德华菌单克隆抗体缓慢加入备用的胶体金溶液中，鮰爱德华菌单克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为0.025：1，经纯化和浓缩后形成胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体；

d. 对金标垫和硝酸纤维素膜处理：将胶体金标记的鮰爱德华菌单克隆抗体以9ul/cm²均匀喷涂在金标垫上；将鮰爱德华菌多克隆抗体稀释成1.2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线a；将羊抗鼠IgG稀释成2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线b，37℃干燥4h；

e. 组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次由上至下呈阶梯状固定于不干胶底板上，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有重叠部分，切成规格宽度的试纸条。