[发明专利]三叶青种质资源的离体保存及保存后恢复生长的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种植物组培技术，特别是一种三叶青种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法。

背景技术

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)又名金线吊葫芦，可用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病,也是抗肿瘤常用药物。其主要活性成份黄酮对肝癌、肠癌、胃癌和血癌细胞株具有“促凋亡作用”。目前该植物野生资源濒临灭绝,且其对生长环境的要求非常苛刻，人工栽培难度大，三叶青药材的来源主要靠扦插，移栽等，但各项技术尚不成熟，繁殖系数低，开发和利用受到极大限制。2011年三叶青被列入“浙江省首批农作物种质资源保护名录”。在保护现有野生资源的同时，利用植物组织培养方法对三叶青种质资源进行离体快繁和试管保存显得十分重要。

离体继代培养技术正日益成为种质资源保存的常用手段。但利用继代培养的方法进行种质保存，一个比较普遍的问题就是继代频繁。每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。不仅如此，一些保存的植物组织培养物，经过多次继代还会引发遗传变异。国内外对三叶青的研究主要集中在临床应用、化学成份以及药理作用方面，组织培养、快繁技术目前有少量报道，但有关其种质资源的离体保存技术以及其遗传评价均未见报道。

另外，三叶青种质资源田间种植难度大，保存工作量大，易受环境气候及病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种不但保存10个月后植株生长正常，而且保存材料的后代未发生遗传性变异的三叶青种质资源的离体保存及保存后恢复生长的方法。

为了实现上述目的，本发明所提供的一种三叶青种质资源的离体保存方法，是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8次后，将其切割成1cm左右的茎段接入培养基1中，所述培养基1是在每升MS培养基中含3mg6-BA和0.5mgNAA；20天后将萌发的腋芽转接到培养基2中进行扩繁，所述培养基2是在每升MS培养基中含2mg 6-BA和1mg NAA；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3中诱导生根，所述培养基3是在每升1/2MS培养基中含2mg IBA；再20天后将形成的试管苗转入培养基4中，所述培养基4是在每升pH值为6.4的1/4MS培养基中附加了100mg水杨酸(SA)、0.2 mg青鲜素、0.3mg6-BA、重量比为10% 蔗糖、 重量比为2% 琼脂，将已转入试管苗的培养基4于低温(8±1)℃和光照600 Lux(6h/天)条件下进行保存。

在此，所述的6-BA是6－苄氨基嘌呤；所述的NAA是吲哚乙酸；所述的IBA是吲哚丁酸；所述的1/2MS培养基、1/4MS培养基都是市售商品的商品名，可以直接购买到的，在此也不作详细说明。

发明所提供的一种三叶青种质资源的离体保存后恢复生长的方法，是将上述所述试管苗在保存材料恢复生长培养基中恢复生长，所述的保存材料恢复生长培养基是在每升MS培养基中附加了0.5 mg赤霉素、3mg6-BA和0.5mg NAA。

本发明提供的三叶青种质资源的离体保存方法，即三叶青试管苗的保存方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果:

1. 本发明首次利用在培养基中添加水杨酸和青鲜素保存三叶青试管苗，并首次利用附加了0.5 mg/L赤霉素的MS培养基对保存后的三叶青试管苗进行恢复培养。

2.本发明所提供的方法用于三叶青离体保存，试管苗保存10个月后存活率仍为100%，且植株生长正常，与常规正常培养基上的试管苗仅能存活3个月相比，大大延长了继代培养时间，使继代间隔由平时的1～2个月继代1次转为10个月继代1次。因此该方法可防止普通的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性。

3.减少生产中繁重的继代工作，而且降低生产操作过程中不必要的人力、物力资源的浪费，为实际生产降低生产成本和提高经济效益提供必要的途径。

4.与传统的三叶青田间种植保存相比，打破了植物生长季节的限制，可随时提供材料，工作量小，同时具有节省贮存空间，便于运输和交流等优点。

5.可避免该濒危种质资源的流失。

6.本发明方法保存10个月的三叶青试管苗，其后代POD同工酶酶谱及引物810的ISSR扩增谱带与对照没有差异，说明保存材料稳定，没有发生遗传变异。

附图说明