[发明专利]猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒感染检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea，PED)在欧洲和亚洲一些养猪业发达的国家都曾有相关报道，是一种危害较为严重的传染病。最近两年来在我国部分养猪场再度爆发了以未断奶仔猪发生水样腹泻、呕吐和高死亡率为特征仔猪腹泻疫情，该病以7日龄内仔猪发病为主，病程急、传播迅速、仔猪死亡率高，而且在同一猪场易呈反复发作，曾一度造成部分猪场出现阶段性产房无仔的严重局面，给养猪业带来了重大的经济损失。在对发生仔猪腹泻疫情的临床样品检测时发现猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性检出率很高，推测PEDV是此次腹泻疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首选，韩国、日本等已经将弱毒疫苗用于该病的预防控制，国内也有一些猪场在使用弱毒疫苗，在临床上如何区分疫苗免疫与自然感染毒株，对仔猪腹泻疫情进行有效地预警具有重要意义。

对于PEDV感染的诊断方法已有多种，如对采集的临床样品进行处理后，利用病毒适应性细胞进行病毒分离的方法；利用免疫胶体金试纸条直接检测样品中的病毒抗原；根据PEDV病毒的保守性内部基因设计引物，利用RT-PCR的方法对病毒的基因进行检测等方法。其中，病毒分离不仅耗时耗力，而且由于该病毒的特性难于细胞上进行分离培养，因此不利于对疫情的及时诊断，后两种方法可以实现对病毒的及时、快速诊断，但是却不能很好的满足对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的需求。PEDV的ORF3基因位于S基因与E基因之间，有研究认为冠状病毒ORF3编码的辅助蛋白具有离子通道的特性与病毒的释放有关，ORF3基因沉默可以降低病毒在Vero细胞上的滴度。

发明内容

本发明要解决目前诊断PEDV感染的方法，不能实现对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的技术问题，提供一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，该试剂盒特异性强、灵敏性高，可快速、准确地区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，对于猪流行性腹泻病毒疫情的早期快速诊断、防控、以及流行病学的全面监测具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含：

针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。

优选的，所述上下游引物的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

更优选的，所述引物的使用浓度为25mmol/L。

所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野毒株对照。

所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒疫苗株对照。

所述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。

优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50℃。

在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。

本发明基于PEDV ORF3基因的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可应用于猪流行性腹泻病的临床诊断、分子流行病学调查等方面，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的PEDV流行毒株ORF3基因缺失区域核苷酸序列比较图；

图2是本发明实施例1的基于ORF3基因序列建立的进化树图；

图3是本发明实施例2确定RT-PCR最佳Tm值的结果图；

图4是本发明实施例2确定RT-PCR最佳引物浓度的结果图；

图5是本发明实施例3的RT-PCR特异性试验结果图；

图6是本发明实施例4的RT-PCR方法敏感性鉴定结果图；

图7是本发明实施例5临床样品的RT-PCR检测结果图。