[发明专利]一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组基因疫苗，尤其涉及一种用于治疗和预防结核病的疫苗，具体来说是一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

结核病是一种传统的对人类健康有重大威胁的传染性疾病，全球大约有1/3的人口感染结核，其中约有10%的人口会急性发病，另外90%的人群主要为潜伏性感染。近年来，由于耐多药结核病的流行、化疗药物的不良反应以及人免疫缺陷病毒（HIV）的感染、免疫抑制剂的使用和老年性结核病等原因引起的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战。尤其是耐多药结核菌（MDR-TB）和广泛耐药结核菌（XDR-TB）的出现，使得结核病面临无药可治的困难局面。作为结核病的传统疫苗-卡介苗（BCG），虽然在动物实验中已证实卡介苗具有高度的保护力，但调查发现，卡介苗对预防儿童结核病效果明显，而对成人结核病预防效果极不稳定，因此研制新的抗结核制剂及新的安全、有效的疫苗迫在眉睫。

结核病主要是由结核分枝杆菌引起的以呼吸道传播为主的感染性疾病，其感染过程，分为初始感染，潜伏感染，再次大量增殖造成的疾病复燃三个阶段。在感染过程中，抗体发挥一定的作用，但由于结核杆菌藏匿于细胞内，细胞免疫在控制结核感染中发挥着更为重要的作用。而结核杆菌的获得性细胞免疫又较为复杂，CD4⁺和CD8⁺T细胞都参与作用，其中目前普遍认为CD4⁺T细胞在免疫中的作用最为关键。人类针对分枝杆菌抗原的体外T细胞反应亦主要为CD4⁺T细胞。动物模型研究提示Th1细胞分泌的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)是导致巨噬细胞活化、吞噬体酸化及反应氧中间代谢产物释放的主要效应物。IFN-γ和白细胞介素12(IL-12)受体遗传缺陷患者对分枝杆菌感染的高度易感性，说明了Th1细胞应答的重要性。另外，在人类和动物模型中的诸多研究显示，CD8⁺T细胞也在抗结核感染中发挥着重要的作用。CD8⁺T细胞主要通过产生细胞因子及直接杀伤细胞发挥效应，人类CD8⁺T细胞可以使靶细胞裂解和通过颗粒溶解素(granulysin)途径来控制细胞生长。

基因疫苗又称DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径激活DC细胞提呈抗原，不仅能够引发体液免疫应答，特别能有效地激活Th1型细胞免疫应答如CD4⁺Th1和CD8⁺T细胞应答，因此有利于清除作为胞内致病菌的结核杆菌。

鉴于结核感染机体免疫的特点和DNA疫苗的优势，我们设想构建一个含有多个不同抗原的多价DNA疫苗，通过诱导强有力的细胞免疫和体液免疫应答，从而达到预防结核菌感染、控制结核菌复制和防治结核病的目的。通过文献分析，我们选择了三个在结核感染中免疫原性较强的抗原作为我们疫苗的候选蛋白：①Rv3615c（Espc）抗原，也属于ESAT6家族，Espc在体外低PH,低铁环境下高表达于巨噬细胞吞噬小体中，显示Espc是活跃表达的，可能在胞内感染中发挥抗原提呈作用，而且已有文献报道，另外，最近也有文献报道，其在结核病的诊断中也发挥着重要的作用。②Mtb10.4抗原，一种结核感染早期的分泌蛋白，已有学者证实，Mtb10.4在结核患者和BCG接种者身上都能引起强烈的免疫反应和很高的保护作用。③Rv2660c抗原，在结核感染的早期和晚期都持续稳定地表达，研究证实在结核杆菌感染的早期，Rv2660c作为一个多阶段疫苗的成员之一，其发挥的保护作用不是很明显，但在感染的后期与结核感染早期的分泌性蛋白联合应用的疫苗却能发挥很好的保护作用。

由于常规BCG疫苗的效果存在争议、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核感染，使得现有技术中的疫苗预防或者治疗结核病的效果不佳。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用，所述的这种结核杆菌三抗原融合基因疫苗及其制备方法和应用要解决现有技术中的疫苗诱导细胞免疫应答水平不高、和预防或者治疗结核病效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种融合蛋白基因，由抗原基因Rv3615c、抗原基因Mtb10.4和抗原基因Rv2660c从5’端到3’端依次串联连接而成。

进一步的，在所述的抗原基因Rv2660c的3’端连接一个Flag标签。