[发明专利]一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐热中性纤维素酶Cel61及其基因和应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40～61%，是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子（WongKK,et al.Microbiol Rev1988,52:305-317.）。木质素约占细胞干重的15～25%，是一种复杂酚类聚合物。纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。按纤维素酶催化反应的最适p H值,可将其分为酸性纤维素酶(最适p H值为3～5)、中性纤维素酶(最适p H值为6～8)和碱性纤维素酶(最适p H值为8～11)（Zhang YHP,et al.Biotechnol Adv2006,24:612-481.）。

纤维素酶有着广泛的应用，例如：造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域。而同时，由于能源短缺和环境的问题，生物能源作为一种新的替代品而备受人们的关注。目前研究最多的主要为微生物来源的纤维素酶，其中真菌由于其分泌量大，且分泌到胞外而成为研究的热点。但是，不同的工业应用，对纤维素酶的性质的需求是不同的，如：饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要嗜碱的纤维素酶。目前工业应用的纤维素酶，主要来自木霉属Trichoderma reesei和Penicillium spp.，这些酶的最适pH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，而嗜热和热稳定性好的酶则有更好的优势：耐热可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。

由于不同工业对纤维素酶需求的不同，因此，获得新型具有优良特性纤维素酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于生物能源、纺织等领域。近年来，人们发现糖苷水解酶61家族的纤维素酶具有氧化酶活性，同时发现在瑞氏木霉纤维素酶系中添加少量61家族的纤维素酶可以大大提高玉米秸秆的水解效率。本专利中高温真菌Humicola insolens X9所产纤维素酶大多为高温中性的特性，并且具有很高的微晶纤维素的降解能力，利于在生物能源工业中应用。本发明中纤维素酶Cel61具有以下性质：最适pH7.0，在pH5～10范围内具有60%以上的酶活力，最适温度65℃，良好的热稳定性，在60℃处理1个小时酶活几乎没有损失，并且与复合纤维素酶协同作用可以有效提高玉米秸秆的水解效率。热稳定性优良并在中性和碱性范围内具有较高酶活力的特性使其在工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐热中性纤维素酶。

本发明的再一目的是提供编码上述耐热中性纤维素酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐热中性纤维素酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐热中性纤维素酶的应用。

本发明从腐质霉(Humicola insolens X9)中分离得到一种新的耐热中性纤维素酶Cel61。

本发明提供了一种纤维素酶Cel61，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

Mkgllsiaalslavgeasahyifqqlstggtkhpmwkyirqhtnynspvidldsndlrcnvgargagtetvtvaagssl tfhldtpvyhqgpvsvymskapgsvsdydgsggwfkiqdwgptftgsgatwklddsytfnipscipdgeylvriqslgihn pwpagipqfyiscaqvrvtgggnanpspqvsipgafketdpgytaniynnfrsytvpgpsvftcsgnsgggsnpsnpnppt pttfttqvttptpvsppsctvakwgqcggqgysgctnceagstcrqqnayysqci

其中，该酶包括296个氨基酸和一个终止密码子，N-端19个氨基酸为信号肽，因此，成熟的纤维素酶Cel61的理论分子量为29.5kDa

本发明的Cel61同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具有高活性。本发明的纤维素酶，其最适pH值为7.0，在pH5.0～9.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为65℃，在60℃和70℃具有良好的热稳定性。