[发明专利]H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，为单股负链RNA，多形态的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纤突，分别具有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的活性。这两个基因是病毒的特异性抗原，根据HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型（H1-H16）和9个N亚型（N1-N9）。

由于禽流感病毒其基因组呈节段复制，通过依赖RNA聚合酶完成复制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒发生基因突变的频率极高。自2013年2月以来，华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。这是首次发现H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速检测方法和研发相应试剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、快速方便的H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse；探针B的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。

引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为1：1：2：1：1：1。

上述H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括反转录反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；反转录反应液每管16μL，含有5×Reverse Transcriptase Buffer 10μL、50pmol9mer Random Primer2μL、10mM dNTP Mixture2μL、40U Ribonuclease Inhibitor1μL和5U/μL AMV Reverse Transcriptase1μL；PCR反应液每管11.4μL，含有2×Premix Ex Taq10μL，20μM H7亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针分别0.2μL、0.2μL、0.4μL，20μM N9亚型禽流感病毒正向、反向引物和TaqMan探针各0.2μL；DEPC水和超纯水各1mL。

发明人针对H7亚型禽流感病毒HA基因和N9亚型禽流感病毒NA基因保守序列，通过Primer Express3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其特异性和引物之间的二聚体，筛选出了2套荧光TaqMan探针和引物，构成专门针对H7亚型和N9亚型禽流感病毒的引物组和探针组，组合成二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，既可确定单个H7亚型或N9亚型禽流感病毒感染，也可一管检测即可确定是否为H7N9禽流感病毒感染，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。本发明在常规PCR的基础上添加了一条标记两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光定量RT-PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，反应结果可以直接通过电脑实时观察，从而实现对H7N9禽流感病毒的快速检测，并根据试验结果判定H7N9禽流感病毒感染，同时还可确定H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒感染，根据本发明建立标准曲线，还可确定待检样品中H7N9禽流感病毒拷贝数。

实验证明，一方面，本发明及其检测方法充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为H7N9禽流感病毒感染；另一方面，若非H7N9禽流感病毒感染，还可确定是否是H7亚型禽流感病毒或N9亚型禽流感病毒感染。

附图说明