[发明专利]一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法

权利要求书

1.一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上臂基因插入质粒pBluescript II SK+的KpnI-XhoI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下臂基因插入质粒pBluescript II SK+的SpeI-SacII内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的卡纳抗性片段插入质粒pBluescript II SK+的BamHI-PstI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的PsbA2启动子插入质粒pBluescript II SK+的SalI-EcoRI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的5ST1T2PCR转录终止子插入质粒pBluescript II SK+的PstI-SmaI内切酶酶切位点之间，制得重组空白质粒；

（2）将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段插入步骤（1）制得的重组空白质粒的EcoRI-PstI内切酶酶切位点之间，制得重组质粒；

（3）将步骤（2）制得的重组质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803，制得转基因集胞藻；

（4）将步骤（3）制得的转基因集胞藻扩大培养后，经提取，制得咖啡酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）的扩大培养，步骤如下：

将转基因集胞藻接种于BG-11液体培养基中，制得原藻液，在28～32℃的条件下培养至OD₇₃₀值为0.6～0.8时，经3000rpm离心10min，收集藻细胞，然后用原藻液1/10体积的新鲜BG-11液体培养基悬浮藻细胞，并添加对香豆酸至终浓度为0.5μM/L，置于28～32℃的条件下培养3天，收集培养液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的BG-11液体培养基，每升组分如下：

BG-11母液10ml，浓度为6mg/ml的柠檬酸铁铵溶液1ml，浓度为20mg/ml的Na₂CO₃溶液1ml，浓度为30.5mg/ml的K₂HPO₄溶液1ml，水定容至1L；

上述BG-11母液，每升组分如下：

NaNO₃149.6g，MgSO₄·7H₂O7.5g，CaCl₂·2H₂O3.6g，柠檬酸0.6g，pH8.0、浓度0.25M的NaEDTA溶液1.12ml，微量元素溶液100ml，水定容至1L；

上述微量元素溶液，每升组分如下：

H₃BO₃2.86g，MnCl₂·4H₂O1.81g，ZnSO₄·7H₂O0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O0.39g，CuSO₄·5H₂O0.079g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.049g，水定容至1L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）的提取，步骤如下：

取4ml浓缩培养后的培养液，经离心，取上清液，调pH至5.0，-20℃保存过夜，经等体积乙酸乙酯萃取，浓缩后的残留物用80%的甲醇溶解，制得咖啡酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心条件为：13000rpm离心2min。