[发明专利]一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法。

背景技术

星斑川鲽(Platichthys stellatus)隶属鲽形目(Pleuronectiformes)鲽科(Pleuronectidae)鲽亚科(Pleu-ronectinae)川鲽属(Platichthys)，俗称珍珠鲽、沼鲽等，英文名Starry flounder(繁星鲽)。星斑川鲽分布于北太平洋的亚洲和美洲沿岸(30°～70°N)海域，主要有北冰洋、东西伯利亚海、白令海峡、鄂霍次克海、朝鲜海峡、日本海、北极的阿拉斯加海湾、波弗特海、楚科奇海、加冕海湾、拉普捷夫海、加利福尼亚海域。主要分布国有加拿大、美国、俄罗斯联邦、中国、朝鲜、韩国和日本等。星斑川鲽目前已经成为重要的养殖鱼种，是具有极高商业开发价值的比目鱼类。日本、前苏联、韩国、加拿大等国家对于星斑川鲽的研究较多；我国对星斑川鲽的研究仅见对星斑川鲽的分类学进行了少量报道。美国和日本对星斑川鲽早期发育作了详细系统的描述。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对星斑川鲽种质需求的不断扩大，星斑川鲽的精子冷冻技术急需建立起来。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。鱼类精液的超低温保存可以使种质的长距离运输得以实现，同时有利于鱼类的杂交、选育、优良性状的获得以及基因多样性的保护。因此，建立星斑川鲽精子大容量超低温保存的可靠方法对海水养殖业的发展以及生物多样性的保护具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，将星斑川鲽的精液与抗冻液按体积比1:3的比例混合，在0℃孵育6-8分钟，孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存；

所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为100mM蔗糖，100mM KHCO₃，25mM NaHCO₃；抗冻剂为终浓度8%的（V/V）DMSO（二甲基亚砜）和终浓度7%的（V/V）Gly（甘油）；添加剂：5mM还原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%蛋黄（V/V）。

所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。所述冻存管为2ml或5ml的冻存管。

所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。

将混合抗冻液和精液的冻存管置于碎冰中（0℃）轻轻震荡混匀6min，使之充分混匀，然后置于0℃平衡2min；而后以分段降温方式处理，即以-8℃/min的降温速率降温至-60℃，然后再以-15℃/min的降温速率降温至-120℃平衡2分钟。

所述星斑川鲽的精液是采集处于繁殖期的星斑川鲽雄鱼，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔、擦净，轻轻挤压腹部获得新鲜精液，而后将活力高于85%的精液与抗冻液混合。

将经液氮处理分装保存的星斑川鲽冻精进行解冻，将其直接放入37℃水浴100s，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。

所述冻精进行解冻直接放入37℃水浴100s，期间不断摇动冻存管。

上述解冻后的冻精采用自然海水激活，载玻片上滴一滴自然海水，置于显微镜下，用牙签的尖部轻轻沾取冻精，在载玻片上的海水里混匀，经计算机辅助分析解冻后精子活率高于70%。

本发明具有如下优点：

1.本发明把星斑川鲽精子经过抗冻剂处理、降温冷冻、置于液氮中长期保存的过程；其冷冻保存方式冻存管容积较大，保存精液量大；

2.本发明采用二甲亚砜（DMSO）与甘油（Gly）混合为抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；

3.本发明的抗冻液中加入了还原型谷胱甘肽5mM；牛磺酸50mM；10%蛋黄（V/V），对精子的质膜起到很好的保护作用；

4.本发明冷冻方式在降温前，鲜精与抗冻液进行了充分的震荡混匀、孵育6-8min，使得鲜精在程序降温冷冻前得到充分的脱水和保护；

5.本发明冷冻分段降温时，采用以-8℃/min速度降温，使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后采用-15℃/min的降温速率快速进入稳定状态-120℃，然后投入液氮；

6.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用二步解冻法，37℃和20℃两步解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤；