[发明专利]改造重组酶FLP的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及改造重组酶FLP的方法及其用途。

背景技术

前人研究表明，一些活性蛋白可被拆分为无活性的肽链，当这些肽链在细胞中同时表达时，该蛋白的活性可获得恢复（Shiba K,Schimmel P.(1992)Functional assembly of a randomly cleaved protein.Proc Natl Acad Sci89:1880–1884;Remy I,Michnick SW.(2004)Mapping biochemical networks with protein-fragment complementation assays.Methods Mol Biol261:411–426）。已经证实，来源于细菌噬菌体P1(Bacteriophage P1)重组酶Cre蛋白可被拆分为N端的α多肽和C端的β多肽，当单独表达任何一段多肽均无重组活性，而两段多肽同时存在时，在动物细胞中获得了完整Cre蛋白32.5%的活性（Casanova et al,（2003）Alpha complementation in the Cre recombinase enzyme.Genesis37:25–29）。另一种对重组酶Cre进行拆分的方式则需要借助其他辅助因子。如将编码Cre基因N端多肽的核苷酸序列与编码FKBP12结合蛋白（FK506-binding protein）的序列构建在一起，同时将Cre基因C端和FKBP12蛋白专一识别的FRP（FKBP12-rapmycin-associated-protein）因子融合，当FK506分子存在时，Cre基因的N端和C端融合蛋白可相互结合，在小鼠细胞中能恢复3～4%的重组活性（Kellendonk et al,（1996）Regulation of Cre recombinase activity by the synthetic steroid RU486.Nucleic Acids Res24:1404–1411;Jullien et al,（2003）Regulation of Cre recombinase by ligand-induced complementation of inactive fragments.Nucleic Acids Res31:el31）。采用同样的原理，如用亮氨酸拉链（Leucine zippers）结构替换上述辅助蛋白因子，可使Cre蛋白的活性提高到30%左右（Xu et al,（2007）Cre reconstitution allows for DNA recombination selectively in dual-marker-expressing cells in transgenic mice.Nucleic acids research35(19):e126）。截至目前，重组蛋白的拆分和重建只在动物细胞中有见报道，在植物细胞中是否可恢复其蛋白活性尚不清楚。此外，对其它的重组酶拆分和重建的研究也并不多。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改造重组酶FLP的方法。

本发明的技术方案是改造重组酶FLP的方法，包括如下步骤：

a、确定拆分位点：以重组酶FLP的N端和C端之间的连接区域为分界点，将FLP拆分为N端FLPn和C端FLPc两部分；

b、构建表达元件：分别构建能够表达FLPn和FLPc的表达元件；

c、转入到表达载体中：将步骤b构建好的表达元件构建到同一个表达载体或者不同的表达载体中。

优选的，步骤a中所述的分界点位于重组蛋白FLP在第150和151个氨基酸之间。

进一步的，步骤b中构建表达元件时，在FLPn和/或FLPc的N端融合核定位信号。

进一步的，步骤b中，在FLPn表达元件和/或FLPc的表达元件的外侧构建两个同向的FLP识别位点FRT。

本发明还提供了上述方法在删除转基因生物中外源基因的用途。

本发明的有益效果：本发明为研究重组酶FLP的功能提供了一种新的思路。本发明提供了将重组酶FLP拆分为无活性的N端和C端，当N端和C端同时存在时，又可以恢复重组酶部分删除活性的氨基酸位点。本发明还为转基因生物安全提供了新的选择。本发明还可以用于杂交作物，用转基因作物生产非转基因产品。

附图说明