[发明专利]基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，具体地，涉及用于检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型以及基于该质谱模型的检测布鲁氏菌的试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌（Brucella）是一种无芽孢、无鞭毛的对人畜有致病力的革兰阴性胞内寄生菌，是布鲁氏菌病（brucellosis，简称布病）的病原体。布病作为一种严重人畜共患传染病,已成为我国重要的公共卫生问题之一。人畜间疫情近10年强势走高，且疫情呈现出从牧区、半牧区向农区甚至城市蔓延的趋势，每年新发病例数为4万人左右，防控形势十分严峻。布鲁氏菌种型包括羊种（3个型)、牛种(8个型)、猪种(5个型)、犬种（1个型）、绵羊附睾种（1个型）及沙林鼠种（1个型），共6个种19个型。布病患者有发热、多汗、肝脾肿大、关节和全身肌肉痛等症状；布病因误诊误治容易转为慢性期，慢性期布病病程长，易复发或发生再感染，可导致病人劳动力降低甚至丧失。动物感染后可导致流产、不孕、繁殖成活率下降等。在我国，布病被列为乙类传染病。

布鲁氏菌因其高致病性、预后差等因素，被卫生部2006年制定的《人间传染的病原微生物名录》定位高致病性的二类微生物，实验活动危险程度高，需在BSL-3实验室中操作，对实验室生物安全环境要求很高。诊断布病的金标准是分离培养布鲁氏菌，然而这种方法风险较大、耗时，阳性率仅为15％～70％。目前，对布鲁氏菌的鉴定主要是基于传统的微生物学检测，操作繁琐，周期较长（7天），约有10%～30%成为无法鉴定的非典型菌株。同时在进行血清学检测时，由于与布鲁氏菌密切相关的菌株间易发生交叉反应，使其检测的特异性降低。以16SrDNA为代表的分子生物学方法可对布鲁氏菌进行鉴定，但需要提取DNA，进行基因测序，费力耗时。

因此迫切需要一种更加快速，可靠，高通量的鉴定方法来应对布病临床诊断与疫情控制。

基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法是近年来出现的用于病原识别的方法，许多国家的科研人员对该方法进行了验证，均表明MALDI-TOF MS满足现代传染病快速诊断的所有要求：快速、准确、易操作、廉价、高通量。目前商业化的用于质谱的微生物鉴定系统有德国布鲁克公司的Biotyer系统及生物梅里埃的Saramis系统。但这两套商业化的数据库内均没有布鲁氏杆菌的标准肽谱，无法识别布鲁氏杆菌。诊断布鲁氏菌感染的临床标本最常见的是血液，急性期病人的菌血浓度很低，临床须在血培养瓶中增菌至一定的浓度才能用于分离检测病原。因菌血样本成分复杂，无法直接用MLADI-TOF MS进行检测。目前，采用MALDI-TOF MS进行菌血的鉴定均是依赖于前端试剂盒（MALDI Sepltyper kit,布鲁克公司）富集病原体，后端病原数据库判定的模式，迄今国内外尚无采用MALDI-TOF MS技术直接检测体液中病原体的技术报道，更无直接检测体液中布鲁氏菌的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前体液中布鲁氏菌检测技术的不足，以血液中直接检测布鲁氏菌为例提供一种用于直接、快速从体液样本中检测感染布鲁氏菌的方法。

本发明首先提供了一种检测布鲁氏菌（Brucella）特征蛋白的质谱模型，含有以下8个特征蛋白，其质荷比m/z分别为：3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9。

进一步，本发明提供了上述质谱模型在制备布鲁氏菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种检测布鲁氏菌特征蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤：

1）将在培养基上培养至对数生长期的布鲁氏菌标准菌株接种于培养瓶中，使菌浓度达到10¹⁰CFU/ml，依次稀释7个数量级至10³CFU/ml，37℃培养,0天、2天、4天、10天、15天;同时设阴性对照；

2）每一取样时段，取上述8个数量级的菌液样本，采用乙醇/甲酸法进行质谱前预处理，制备蛋白样品；

3）将上述8个数量级的菌液、在5个时间段的40个蛋白样品和阴性对照血液样品处理得到的蛋白分别上质谱仪样品靶，设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；采集2000-20000Da范围内的肽图谱；对所得数据进行统计学处理，得到具有统计学意义的布鲁氏菌8个特征蛋白，其质荷比分别为：3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9，将上述8个特征蛋白作为检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型。