[发明专利]一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法

权利要求书

1.一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，包括：

（1）提取锈斑蟳基因组DNA并稀释备用；

（2）设计5’锚定引物及PCR扩增；

（3）克隆扩增产物及测序；

（4）微卫星分子标记序列分析及微卫星特异引物设计；其中，微卫星分子标记及其对应的特异引物序列如下所示：

Cfe-1标记：如SEQ ID NO:1所示；

Cfe-1标记的特异引物序列：

F：ATGCTTGCTATTATTTTCTACTG；

R：GAGCAAATTAAGATTGACTGA；

Cfe-2标记：如SEQ ID NO:4所示；

Cfe-2标记的特异引物序列：

F：GAGTGGTAATGGGAGCAAATG；

R：TCCACATGCTCGTAAAACAAA；

Cfe-3标记：如SEQ ID NO:7所示；

Cfe-3标记的特异引物序列：

F：GGGATGTAAGACAATGTGAAC；

R：TTATACACCAATCTATATTAATTTC；

Cfe-4标记：如SEQ ID NO:10所示；

Cfe-4标记的特异引物序列：

F：ACCAGCCGTAATGCAGAACAC；

R：AAAACCCTGAGAAAGGATTGCA；

Cfe-5标记：如SEQ ID NO:13所示；

Cfe-5标记的特异引物序列：

F：CTTCCCCTTGGATGACGCTC；

R：GACTTAAACTCCCTTTGCTACCTG；

（5）使用引物对锈斑蟳不同个体的基因组DNA进行PCR扩增；

（6）使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；

（7）根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。

2.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中的提取锈斑蟳基因组DNA包括以下步骤：剪取锈斑蟳肌肉组织100-150mg，置于500μL组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/mL的蛋白酶K和终浓度为100μg/mL的RNase A，55℃消化2-3个小时；用体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇混合液抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃备用。

3.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的设计5’锚定引物包括以下步骤：设计含有兼并碱基及重复碱基的引物，其中重复碱基部分为2个碱基6次重复、3或4个碱基4次重复，用于与基因组DNA中的重复碱基结合；

采用的引物有PCT6：5’-KKVRVRV(CT)₆-3’；PGT6：5’-KKRVRVR(GT)₄-3’；PCAC4：5’-KKBDDBD(CAC)₄-3’；

所述的PCR扩增包括以下步骤：每个5’锚定引物以锈斑蟳基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、Mg²⁺终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。

4.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）中的克隆及测序包括以下步骤：首先是将回收的PCR产物连接到pMD19-T载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，接种到LB Amp⁺培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-1000bp的阳性克隆利用ABI3730自动测序仪进行测序。