[发明专利]羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子多克隆抗体的获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，尤其是一种羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子多克隆抗体的获取方法。

背景技术

RERG（ras-related and estrogen-regulated growth inhibitor）基因属于ras超家族基因。ras超家族是一类重要的功能蛋白，其介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的通路，对细胞生长、分化、存活、增值等多种功能的调节发挥重要作用。它们在细胞信号转导中可作为信号转换器或分子开关，从而对动物的生长发育等起着重要的调控作用。因此，对羊RERG基因突变的遗传效应分析有助于进一步揭示动物生长发育调控的分子机制，同时也为贵州地方品种羊分子育种提供理论基础。2001年，美国Finlin等运用微阵列统计分析（statistical analysis of microarray，SAM）鉴别并命名了一种新颖基因—ras相关的、雌激素调节的生长抑制子。在MCF-7人乳腺癌细胞中，可以发现RERG经过β-雌二醇处理后快速表达，而他莫昔芬却可抑制其表达。对RERG的序列进行分析发现，5′上游可能存在两个雌激素受体结合区，进一步可以证明其依赖于雌激素调节。RERG基因被定位于人染色体12p12，由4个外显子组成，前两个外显子被一个95 kb的内含子隔开。它编码199个氨基酸，其分子蛋白质量是23 kD。RERG与部分ras超家族成员的同源性可达40%—50%，也拥有保守的GTP结合域，但在C′末端却缺乏参与脂质修饰的相应基序，这表明它不受翻译后异戊二烯化调节。观察RERG在细胞内的定位，发现其均匀地散布在胞浆中，也有少量存在于胞核内。RERG基因首次报道是在人乳腺癌方面，它在肿瘤中高度表达，其生长比较慢，而低度表达甚至是无表达时肿瘤的增值速度明显加快。早期研究发现，羊RERG基因座位与生长性状存在显著关联。

黔北麻羊是贵州省三大优良山羊品种之一。其历史悠久，发祥较早，适应能力强，耐粗饲，繁殖率高,产肉性能良好，膻味轻，肉鲜美可口，板皮品质优良等优点为当地群众所喜养。罗卫星等对黔北麻羊的肉用性能和肉质特征进行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉质性质良好，具有很好的开发价值。目前，在GenBank 数据中已经能搜索到人、牛、鼠等动物的RERG基因(ras相关的、雌激素调节的生长抑制子)的序列，但未见羊的RERG基因序列。

发明内容

本发明的目的是：提供一种羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子基因的多克隆抗体的获取方法，它能有效的获得效价高、特异性好的羊RERG基因的多克隆抗体。

本发明是这样实现的：羊独RERG基因的多克隆抗体的获取方法，利用设计的特异性引物将羊RERG基因进行PCR扩增，获得它的CDS序列；并通过酶切位点引物来构建原核表达载体，获得原核表达载体pET32a- RERG；再将原核表达载体pET32a- RERG进行目的基因的诱导表达，获得羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子蛋白；将羊RERG蛋白纯化至85%以上；将纯化后的羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子蛋白免疫到动物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分离血清；将血清纯化后，获得目的羊ras相关的、雌激素调节的生长抑制子多克隆抗体；特异性引物包括上游引物：5 ' ATTGTCTACCAGCACCCAGCAT -3及下游引物：5'- TCAGCAGTTAGGCAACTTCG- 3’；酶切位点引物包括上游引物： 5'- GCGGATCCATGGCTAAAAGTGCAGAGGTC-3' ，该引物序列的下划线为BamHⅠ位点；下游引物：5'-CGCTCGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGACTGCTGATTTTGGTGAGCAT-3' ，该引物序列的下划线为XhoI位点。

为了验证本发明的效果进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1 试验动物

    从贵州省习水县采集成年黔北麻羊。山羊经放血致死，用经过180℃干烤4h-6h的外科手术器械快速采集肌肉和内脏等样品、液氮中速冻，-80℃冰箱保存备用。

1.2总RNA的提取及质量、浓度测定

根据RNA提取试剂盒说明书用Trizol法提取贵州黑山羊脾脏总RNA，用血液RNA提取法提取贵州黑山羊血液总RNA。1%琼脂凝胶糖检测总RNA的完整性，核酸蛋白测定仪测定浓度，-80 ℃保存备用。

1.3 引物设计及克隆