[发明专利]通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种结直肠癌免疫学指标预后评价的方法。具体涉及一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法。

背景技术

法国的国家卫生医药研究院的Jerome Galon等2006年发表于science杂志的一项研究提示T细胞浸润部位、类型及程度是结直肠癌预后判断的重要指标，而CD8+细胞在肿瘤组织中央和边缘的浸润程度对于预后预测的准确性达到65.3%，高于TNM分期的50-60%，并且ROC曲线提示免疫学评分在临床具有更好的可操作性。他们建立了以CD8+和CD45RO+细胞数量和浸润位置为基础的一套结直肠癌肿瘤免疫环境评分标准，肿瘤两个部位浸润的CD8+和CD45RO+细胞数量都少为0分，肿瘤两个部位浸润的CD8+和CD45RO+细胞数量都多为4分，免疫评分为4分的病例组里只有4.8%的患者复发，五年生存率达到86.2%，而免疫评分为0分和1分的病例组里有72%的患者复发，五年生存率只有27.5%，此后结直肠癌的免疫细胞浸润与预后评判作用引起广泛关注。

目前可以提供准确可靠的结直肠癌患者预后信息的分子靶标非常少，1998-2012年间国外文献报道的关于结直肠癌免疫学指标预后评价作用的研究有26个之多，评判标准也杂乱不齐，因而一直没有规范研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述的评估结直肠癌患者预后评价的缺陷而提供一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，即先通过CD8阳性细胞数目进行免疫评分，然后通过CD8阳性表达量确定与患者预后的关系。

本发明的技术方案

一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，具体包括如下步骤：

（1）、首先，将手术切除的64-180个结直肠癌肿瘤组织标本进行石蜡包埋，制成组织蜡块；

（2）、然后，根据HE染色确定步骤（1）所得的蜡块中肿瘤组织的位置，选取其中的肿瘤组织的中央部位制成含有64-180个点位的组织芯片；

（3）、接着，对步骤（2）所得的组织芯片、阳性对照和阴性对照进行免疫组织化学染色（王光辉2013年Identification of MXRA5 as a novel tissue biomarker for colorectal cancer progression）；

其中阳性对照使用已证实为阳性组织的肿瘤细胞组织制成的组织芯片；

阴性对照使用相同的组织芯片；

（4）、组织芯片常规脱蜡、水化；

（5）、微波抗原修复；

将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟×2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次；

（6）、灭活内源性过氧化物酶：

用30%过氧化氢和甲醇配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次；

（7）、封闭非特异性蛋白：

将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原；

（8）、滴加一抗：

CD8一抗（clone c8/144B，Daka）用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀释，至于湿盒里4℃孵育过夜；阴性对照以PBS缓冲液代替一抗；

（9）、复温45分钟；

（10）、滴加二抗

抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒即以下简称二抗试剂盒，将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加二抗试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时；

（11）、DAB显色：

二抗试剂盒即中的B液即DAB原液和C液即DBA缓冲液按照B液:C液为1：50的比例配置成显色液，每张组织切片加入70ul的显色液，在显微镜下控制显色时间，观察到出现阳性结果又无明显背景着色时中止反应，用蒸馏水冲洗10分钟；

（12）、苏木素复染；

（13）、脱水和透明；

（14）、封片；

（15）、结果分析：