[发明专利]表达热稳定纤维素酶基因融合体61F-EG1的毕赤酵母工程菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus克隆出61家族糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶eg1通过融合PCR构建的毕赤酵母工程菌株GS-61eg1-134。 

(二）背景技术

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和61家族糖苷水解酶。 

嗜热子囊菌光孢变种产生的61家族糖苷水解酶61F具有微弱的纤维素酶活性，通过使用接头序列将61f和eg1融合表达后，其内切纤维素酶活性明显提高，为EG1活性的2.7倍。 

（三）发明内容

本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得的61家族糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶基因eg1，通过融合PCR得到61f-eg1基因，该基因cDNA全长1638bp，编码545个氨基酸。 

构建重组表达质粒载体pPIC9K/61f-eg1，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-61EG1-134。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d，纯化后融合蛋白的表达量为4.32mg/ml，分子量为58.8KDa，酶活力为13.6U/ml，重组蛋白61F-EG1在60℃下是稳定的；70℃处理60min后仍保持90.34% 的活性；80℃处理60min后保持75.65%的活性；90℃下半衰期为50min。 

（四）附图说明：

图1融合蛋白61F-EG1的SDS-PAGE分析 

泳道1：纯化的融合蛋白61F-EG1 

泳道2：低分子量蛋白标准（自上至下依次为116kDa，66.2kDa,45KDa,35kDa） 

图2融合蛋白61F-EG1与61F、EG1单独表达时的酶活比较 

图3融合蛋白61F-EG1最适反应温度 

图4融合蛋白61F-EG1热稳定性 

图5融合蛋白61F-EG1最适反应PH 

（五）具体实施方式

实施方式1：嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus的分离鉴定 

（1）标本采集：从堆肥中采集。 

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。 

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。 

实施方式2：糖苷水解酶基因61f和内切葡聚糖酶eg1的基因融合 

（1）嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。 

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL， 将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture2μL，10×RT Buffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer1μL，RNase Inhibiter0.5μL，AMV Reverse Transcriptase1μL（Final Volume20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。