[发明专利]一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸是一种天然的二元四碳羧酸，是生物体三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循环中的一个中间产物，同时又是许多厌氧和兼性厌氧微生物的发酵终产物之一。琥珀酸作为一种重要的有机合成中间体，被广泛应用于食品、医药、香料、农药、染料、油漆和塑料等领域中，并且被用于生产许多化工产品如己二酸、1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮和2-吡咯烷酮等，因此有着广阔的需求市场。并且随着一些新应用领域的不断拓展，琥珀酸的需求量继续猛增。以碳水化合物等可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产琥珀酸可以替代目前人类基于石油化工原料生产琥珀酸，是一种环境友好的绿色技术。

能够发酵积累琥珀酸的微生物菌株有很多，目前用于研究的菌株主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）、产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimia succiniciproducens）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和大肠杆菌（Escherichia coli）。作为厌氧菌，产琥珀酸厌氧螺菌发酵条件较为苛刻，营养需求丰富，发酵周期较长，无法耐受高浓度的葡萄糖和琥珀酸，并且具有潜在的致病性；产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼海姆菌属于瘤胃菌，发酵过程需要绝对厌氧，而且其生理、代谢和遗传背景并不十分清楚，遗传工具发展也不成熟，使得发酵副产物的产生不可避免。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，即可以在好氧条件下进行快速生长，又可以在厌氧条件下进行混合酸发酵。作为一种模式生物，大肠杆菌遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究琥珀酸发酵途径和提高琥珀酸产量的理想载体。大肠杆菌代谢工程菌株生产琥珀酸可以在好氧、微好氧或厌氧条件下进行：（1）好氧条件下，大肠杆菌工程菌株具有较快的生长和碳源代谢速率，但是当菌株进入稳定期或高细胞密度发酵时，往往会出现溶氧不足，而造成琥珀酸产生速率的降低和厌氧发酵副产物乳酸等的积累。（2）微好氧条件下，培养过程简单、容易扩大，能够降低发酵工业中最大的能量消耗成本----通气搅拌成本。工程菌株具有较快的碳源代谢速率，但是微好氧生长较为缓慢，发酵周期长，不利于设备的周转。（3）厌氧发酵条件下，具有最高的琥珀酸转化率（理论转化率较好氧条件下提高71.4%），但是厌氧条件下大肠杆菌生长较为缓慢，发酵周期长，不利于设备的周转。（4）目前通常采用的好氧生长-厌氧发酵的两阶段策略，这一方法虽然解偶联了生物量的积累和产物的产生过程，琥珀酸的生产能力通常受限于由好氧生长转移至厌氧发酵时刻细胞的生理状态；而且好氧生长过程没有琥珀酸的积累，不仅降低了碳源总转化率，而且降低了整个发酵过程中琥珀酸的总生产力（overall volumetric productivity）。针对以上琥珀酸生产过程中的优势与瓶颈，如果能够构建了一株好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株，该菌株能够快速生长并偶联琥珀酸的好氧生产，当菌株进入稳定期时控制发酵进入微好氧条件，更快地积累琥珀酸，最后转为厌氧条件，更高地转化葡萄糖为琥珀酸，并降低通气搅拌成本，琥珀酸的生产能力不再受限于转移时刻细胞的生理状态，而且无需像严格厌氧发酵那样需要在氮气或二氧化碳保护等辅助手段下进行。这样一株大肠杆菌琥珀酸生产菌株和全阶段发酵策略，将能够很好地解决了好氧琥珀酸发酵碳源转化率低、微好氧和厌氧琥珀酸发酵周期长和设备周转率低、及好氧生长-厌氧发酵的两阶段策略中琥珀酸生产能力不稳定和总生产力低的缺点。

经检索，利用好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌还未见报道。

发明内容

针对利用大肠杆菌好氧、厌氧和好氧-厌氧两阶段发酵琥珀酸过程中存在的缺陷，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用。